A acne vulgar é doença inflamatória da pele que leva a um comprometimento da qualidade de vida e, portanto, não é apenas questão estética. Sua patogênese é multifatorial – de particular importância é a colonização pela bactéria Propionibacterium acnes. Há uma ampla gama de diferentes opções de tratamento, incluindo tratamentos tópicos e sistêmicos, dependendo da gravidade. A terapia de alta frequência (AF), desenvolvida historicamente no século XIX, alega efeitos antimicrobianos na pele com acne, mas faltam dados sólidos sobre sua eficácia e mecanismo de ação.
ObjetivosO objetivo principal deste estudo foi determinar a eficácia da terapia de AF na flora cutânea e P. acnesin vitro utilizando dispositivo comercial, bem como revisar estudos sobre o mecanismo de ação.
MétodosA fonte de plasma foi investigada em relação às configurações elétricas, calor e desenvolvimento de ozônio. A flora bacteriana cutânea, isolados de fungos e P. acnes foram expostos à AF in vitro e comparados a controles não expostos, avaliando o número de colônias em placas de ágar. Para análise extra das espécies bacterianas da flora normal da pele, foi realizado o sequenciamento 16S. As análises estatísticas foram realizadas usando o test t não pareado para amostras armazenadas em linha.
ResultadosO tratamento com AF levou a redução significativa de quase todas as espécies bacterianas e fúngicas investigadas no presente estudo. Além disso, o número de unidades formadoras de colônias (UFC) de P. acnes diminuiu significativamente após o tratamento com AF em comparação aos controles in vitro.
Limitações do estudo: Os experimentos foram realizados apenas in vitro; para avaliar os efeitos clínicos, são necessários mais experimentos in vivo.
ConclusõesOs resultados coletados no presente estudo, embora in vitro, fornecem uma base mecanicista para a AF como opção de tratamento complementar para pacientes com acne. O tratamento também pode ter efeito benéfico em pacientes com Infecções cutâneas superficiais.
A acne vulgar afeta aproximadamente 80% dos adolescentes e, portanto, é um dos motivos mais comuns de consulta com um dermatologista.1 A patogênese dessa doença inflamatória cutânea é multifatorial, incluindo aumento da produção de sebo, queratinização folicular alterada, colonização bacteriana por Propionibacterium acnes e inflamação.2–4 Ela é dividida em quatro graus, de leve (incluindo comedões e poucas pápulas inflamatórias) a grave (associando nódulos inflamatórios e formação de cicatrizes).5 Além disso, a acne é considerada doença estigmatizante que induz baixa autoestima e retraimento social, também refletido por alto escore no Dermatology Life Quality Index (DLQI), semelhante àquele de pacientes com psoríase vulgar.6 Assim, a demanda por tratamentos eficazes é particularmente alta. Há uma infinidade de opções de tratamento, desde medicamentos de venda livre até terapias orais, incluindo retinoides e antibióticos. Recentemente, os dispositivos de alta frequência ganharam cada vez mais atenção, alegando ajudar a drenagem linfática, prevenir a queda de cabelos e o desenvolvimento de rugas e, por fim, melhorar as lesões de acne. Esses dispositivos de alta frequência, coloquialmente denominados violet wand (VW), fornecem Plasma de Pressão Atmosférica Frio (CAPP, do inglês cold atmospheric pressure plasma). O CAPP tem múltiplas propriedades bioativas – por exemplo, pela liberação de partículas carregadas e radicais reativos (O3, NO, NO2).7 No início do século passado, a terapia de alta frequência (AF) já era conhecida como opção de tratamento versátil em pacientes com doenças infecciosas da pele, eczema e feridas. Além disso, até enxaquecas, neuralgia, tuberculose e muitas outras doenças foram tratadas por esse método.8 Provavelmente em decorrência do desenvolvimento dos antibióticos e por falta de dados sobre sua eficácia, tornou‐se menos importante em meados do século passado. Não apenas por seus efeitos antimicrobianos como “antisséptico físico” mas também pelo aumento global de cepas bacterianas multirresistentes, a medicina do plasma é atualmente um campo emergente, e os estudos em andamento são onipresentes. Recentemente, foi demonstrado que os dispositivos de AF são mais eficazes do que os antissépticos comuns no ataque contra patógenos de feridas in vitro,7,8 questionando se a terapia de AF também pode ser benéfica na pele com propensão a acne e como ela afeta a flora comum da pele.
Materiais e métodosFonte de plasmaNeste estudo, o dispositivo Signstek Portable High Frequency Machine (Signstek, Full Rise LLC, Wilmington, DE/EUA) com marcação CE (aprovada para uso em seres humanos na Europa) foi utilizado. Consiste em dispositivo portátil com um regulador de intensidade na parte inferior e uma saída para conectar diferentes tubos de vidro preenchidos com hélio abaixo da pressão atmosférica. São fornecidos quatro tubos de vidro diferentes: um tubo em formato de pente para tratar o couro cabeludo, um tubo em formato de língua para áreas sensíveis (como olheiras, nariz ou lábios), outro em formato de cogumelo para grandes áreas (regiões frontal e dorsal) e um tubo curvo com ponta esférica para áreas regulares como a região bucinadora (fig. 1a).
Fonte de plasma e efeitos do mecanismo. (A) O dispositivo de plasma é composto por um dispositivo portátil com ajuste de intensidade e diferentes tubos de vidro para conectar. Há formação de plasma de cor laranja quando ligado. (B) Fotos tiradas com câmera termográfica após 0, 1, 2 e 4 minutos sem nenhum sinal de desenvolvimento de calor. (C) Formação de ozônio durante o tempo medido por um detector de O3 demonstrando aumento da concentração de O3 já depois de 10 minutos. A linha tracejada indica a concentração limite de odor para ozônio (20‐40μg/m3; 0,01‐0,02ppm).
Em todos os experimentos relatados aqui, o tubo curvo foi utilizado a uma frequência de trabalho de 50Hz A intensidade foi regulada em 50%.
Medidas técnicasA intensidade da corrente foi medida para três condições (potência baixa, média e máxima) utilizando amperímetro padrão (Multimeter ABB Metrawatt 2012). A tensão aplicada correspondia à da tomada elétrica (na Alemanha: 230V).
Avaliação do desenvolvimento de calorPara investigações adicionais sobre o mecanismo preciso de ação da fonte de plasma, uma câmera de imagem térmica (FLIR MS Technology C3, FLIR® Systems, Inc., Wilsonville, Oregon, EUA) foi utilizada para detectar o potencial desenvolvimento de calor. As fotos foram tiradas após 1, 2 e 4 minutos de tratamento de uma placa de ágar com AF para se assemelhar a um experimento com bactérias.
Formação de ozônioA concentração de ozônio (O3) foi medida utilizando um detector de O3 (Leory PM 2.5 O3 Ozondetektor TVOC, Thingnovation, Shenzhen, China). A fonte de plasma foi ligada a 100% em uma sala com janelas e portas trancadas, de aproximadamente 10,5 m3. Os tempos de medida foram aos 10, 20, 30, 40 e 50 minutos.
MicrobiologiaBacteriologiaPara estudar os efeitos da terapia de AF sobre as bactérias, foram obtidos swabs de pele saudável em três áreas diferentes do corpo (região frontal, antebraço e área genital) de um indivíduo saudável. Em um segundo experimento, Propionibacterium acnes (ATCC® 6919™) foi testado separadamente.
MicologiaPara avaliar adicionalmente os efeitos sobre fungos, isolados clínicos de Trichophyton mentagrophytes, T. violaceum, T. mentagrophytes, T. benhamiae, T. rubrum e Microsporum canis, preparados por assistentes médico‐laboratoriais, foram tratados conforme mencionado a seguir.
Culturas de bactérias/fungosA flora da pele de três diferentes áreas do corpo foi isolada em placas de ágar sangue e incubada por 24 horas a 37°C antes do tratamento com AF.
Propionibacterium acnes, como bactéria anaeróbica, foi cultivada em um frasco anaeróbio (BD BACTEC™ Lytic/10 Anaerobic/F Culture Vial) até atingir densidade celular aproximada de 3,0×108 UFC/mL referente ao padrão McFarland n° 1, e em seguida tratada com AF em uma placa de ágar sangue. Após o tratamento, as placas foram incubadas por sete dias a 37°C em condições anaeróbicas usando BD GasPakTM. Espécies fúngicas foram cultivadas em BD Dermatophyte Agar por sete dias a 37°C antes do tratamento.
Modelo in vitro para testes de alta frequência em bactérias/fungosApós a incubação, cada colônia investigada foi ressuspensa em aproximadamente 0,5mL de solução salina 0,9% estéril. Para a flora da pele, foram escolhidas cinco colônias de aparência morfologicamente diferente para avaliação posterior. Em seguida, 1μL da solução microbiana foi aplicado centralmente nas placas de ágar apropriadas em pares. Em seguida, o dispositivo de AF com o tubo curvo anexado e desinfetado com lenço umedecido foi fixado em um suporte a uma distância de 5mm acima da placa. De cada par, uma placa foi tratada por 1 minuto, enquanto a outra serviu como controle para determinar a diferença relativa. No caso de P. acnes, os períodos de tratamento variaram entre 1 e 8 minutos (1, 2, 4 e 8 minutos de tratamento de AF). Subsequentemente, a solução microbiana de placas tratadas e não tratadas foi espalhada utilizando esferas de vidro esterilizadas, seguido por um período de incubação a 37°C por um dia para a flora da pele e sete dias para P. acnes e fungos. Após a incubação, em placas com aproximadamente mais de 1.000 colônias, três áreas de 1cm2 foram contadas em cada placa de ágar, e os valores médios foram multiplicados pelo tamanho da placa de ágar (57cm2) para obter o número absoluto de colônias por placa. Placas com 100 a 1.000 colônias foram divididas em quartos, e um quarto contado foi multiplicado por quatro, enquanto placas com menos de 100 colônias foram contadas de maneira completa.
Sequenciamento 16SAs colônias bacterianas de cada par de placas foram ainda caracterizadas por meio de PCR (Kit HotStarTaq Master Mix, Qiagen), como descrito anteriormente.9
Os primers 27f (5’‐AGA GTT TGA TCA TGG CTC A‐3’) e 1492r (5’‐TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T‐3’) amplificaram parcialmente o rRNA do gene 16S usando um termociclador (Biometra Professional Basic, Analytik Jena GmbH, Jena, Alemanha).
Os produtos de DNA foram detectados por eletroforese em gel de agarose a 1,0% para confirmar uma amplificação bem sucedida. O sequenciamento de Sanger foi realizado pela Eurofins Genomics (Ebersberg, Alemanha) utilizando o primer 27f. As sequências obtidas foram alinhadas usando a ferramenta online BLASTn para identificar as espécies (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; NCBI).10
Análise estatísticaPara observação e análises estatísticas (teste t de Student não pareado para amostras armazenadas em linha) foi utilizado o GraphPad Prism (versão 9.0.0, GraphPad Software Inc, San Diego, CA/USA) e os dados foram dispostos em gráficos em escala logarítmica. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os valores a seguir são apresentados como média±desvio padrão. O nível de significância foi estabelecido em p <0,05 (*), p <0,01 (**) e p <0,001 foram considerados altamente significativos (***).
ResultadosAvaliação de dados técnicos e mecanismo de açãoPara avaliar a intensidade da corrente elétrica durante o tratamento, foi utilizado um multímetro mostrando corrente variando de 0,28 (potência total) a 0,32 ampère (potência baixa) na tensão de 230V.
O desenvolvimento de calor após 1, 2 e 4 minutos de tratamento com AF não foi observado. As fotos tiradas com câmera termográfica não mostraram alterações na temperatura durante o período investigado (fig. 1 B).
A formação de ozônio com concentração de 0,015ppm foi observada após 10 minutos do dispositivo totalmente ligado. Após 20 minutos, as concentrações de O3 quase dobraram (c=0,027ppm). Com tempos maiores os níveis de concentração aumentaram (c=0,032 após 30 minutos, c=0,040 após 40 minutos, c=0,090 após 50 minutos; fig. 1C).
Efeitos da terapia de alta frequência contra a flora cutâneaPara avaliar a eficácia da terapia de AF contra a flora comum da pele, as placas de ágar sangue com e sem tratamento de AF foram contadas após o período de incubação seguido por PCR para especificar as espécies bacterianas. Em termos gerais, para quase todas as espécies identificadas, observou‐se redução significativa na contagem de colônias. Mais precisamente, na região frontal, detectamos duas vezes Micrococcus yunnanensis, Aerococcus viridans, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus capitis. Micrococcus yunnanensis foi reduzido em 67,5% (31267,0±81,7 vs. 1016,3±57,1; p <0,001) e na segunda placa em 12,5% (6405,0±18,5 vs. 5605,3±19,4; p <0,001), A. viridans em 26,1% (9339,0±72,1 vs. 6906,3±58,8; p <0,001), S. epidermidis em 83,43% (3785,7±68,7 vs. 627,3±18,2; p <0,001) e S. capitis em 41,9% (1488,0±70,4 vs. 864,3±30,3; p <0,001).
O mesmo foi observado para as bactérias do antebraço: B. cereus foi reduzido em 75,9% (11396,3±757,7 vs. 2750,7±127,9; p <0,001), S. capitis em 63,9% (2700,3±104,0 vs. 973,7±25,1; p <0,001), A. urinaeequi em 95,1% (16201,0±757,9 vs. 800,0±35,0; p <0,001), M. yunnanensis em 99,0% (7209,3±344,8 vs. 75,0±12,8; p <0,001) e M. luteus em 3,1% (6280,0±443,3 vs. 6087,7±119,3; p=0,5).
Em relação às espécies bacterianas na região genital, S. capitis foi reduzido em 81,6% (31699,3±763,7 vs. 5839,7±111,3; p <0,001), S. lugdunensis em 97,6% (15214,3±405,1 vs. 363,3±16,2; p <0,001), M. luteus em 17,9% (957,0±37,6 vs. 785,3±2 2,3; p=0,002), S. haemolyticus em 99,0% (6684,0±273,0 vs. 70,0±7,2; p <0,001), M. yunnanensis em 70,3% (4322,0±252,3 vs. 1284,3±86,4; p <0,001; fig. 2 A).
Efeitos da terapia de alta frequência contra dermatófitos
O próximo passo do presente estudo foi avaliar adicionalmente os efeitos do tratamento da AF contra uma seleção aleatória de dermatófitos. O número total de colônias de todos os dermatófitos foi significativamente reduzido em 58,0% após o tratamento com AF (55,8±33,6 vs. 18,2±6,5; p=0,040). Mais precisamente, as colônias de T. mentagrophytes foram reduzidas em 61,5% (69,3±4,0 vs. 26,7±3,1; p <0,001), de T. violaceum em 78,6% (103,0±6,6 vs. 22,0±3,0; p <0,001), de T. benhamiae em 45,2% (17,7±1,5 vs. 9,7±1,5; p=0,003), de M. canis em 69,1% (65,7±2,1 vs. 20,3±1,5; p <0,001) e de T. rubrum em 61,6% (31,3±1,5 vs. 12,0±2,0; p <0,001; fig. 2 B).
Efeitos da terapia de alta frequência contra P. acnesUma abordagem adicional para verificar se o tratamento de AF é benéfico contra P. acnes, este foi tratado por AF ao longo do tempo (fig. 2C). As UFC em diferentes placas de ágar sangue foram contadas antes e após 1, 2, 4 e 8 minutos de tratamento com AF. Resultados significativos foram alcançados após 1 minuto de tratamento (7288,0±145,9 vs. 30,0±3,6; p <0,001). A continuação do tratamento por 2, 4 e 8 minutos levou a diminuição ainda maior da quantidade de UFC. Ao comparar os valores após 2 e 4 minutos de tratamento, observou‐se redução ainda mais significativa do número de UFC de P. acnes (4,7±0,6 vs. 1,3±1,5; p=0,020). O tratamento prolongado por mais de 8 minutos pareceu não ter benefícios adicionais (1,3±1,5 vs. 1±0; p=0,700; fig. 2C).
DiscussãoNo presente estudo, o tratamento com AF demonstrou efeito microbicida na flora da pele e patógenos in vitro, com diminuição significativa nas contagens bacterianas e fúngicas após curto período de tratamento.
Embora tenha sido demostrado que os dispositivos de AF não funcionem por meio do desenvolvimento de calor, foi observado aumento da formação de O3 durante o tempo de aplicação, sugerindo que seus principais efeitos antimicrobianos são provavelmente mediados pelo desenvolvimento de gás ozônio e, portanto, estresse oxidativo para os micróbios. Sabe‐se que o O3 tem efeito anti‐inflamatório com propriedades antimicrobianas.11,12 Em altas concentrações (geralmente >200μg/m3,> 0,1ppm) por períodos prolongados de tempo, o O3 pode contribuir para o desenvolvimento de doenças pulmonares, como DPOC ou enfisema,13,14 mas a quantidade de O3 no tratamento de AF é muito pequena e o tempo de aplicação muito curto para causar problemas de saúde. Foi possível demonstrar que a flora cutânea de três áreas diferentes do corpo, incluindo diferentes bactérias aeróbicas, foi significativamente reduzida após 1 minuto de tratamento com AF. De acordo com o que foi mostrado, um estudo anterior demonstrou erradicação completa in vitro de isolados de feridas bacterianas.8 Além disso, os resultados do presente estudo estão de acordo com os achados de um estudo de 2015, mostrando que CAPP e VW podem reduzir uma variedade de bactérias, incluindo cepas multirresistentes como Staphylococcus aureus resistente à oxacilina (MRSA) e Enterococcus resistente à vancomicina (ESBL), bem como fungos, como a levedura Candida albicans. Os efeitos antimicrobianos da VW não diferiram de maneira relevante dos dispositivos modernos de AF.7 O presente estudo e estudos anteriores destacaram claramente as propriedades antissépticas das terapias de AF, sugerindo que a AF, no lugar de antibióticos, pode ser opção de tratamento antimicrobiano alternativo para infecções superficiais de fácil acesso, especialmente porque as cepas bacterianas multirresistentes estão aumentando. Além disso, o efeito antimicrobiano também é importante para a redução da colonização por P. acnes, pois foi possível demonstrar redução significativa após 1 minuto de tratamento com o dispositivo de AF. Uma vez que P. acnes é uma causa chave na patogênese da acne vulgar, sua redução pode representar importante opção de tratamento complementar.
ConclusãoOs resultados coletados neste estudo, embora in vitro, fornecem uma base mecanicista para a AF como opção de tratamento complementar para pacientes com acne. Também pode ter efeito benéfico em pacientes com infecções cutâneas superficiais. Como os resultados in vitro são promissores, mais estudos in vivo são necessários para comprovar a eficácia e a tolerabilidade na prática diária com seguimentos em longo prazo para monitorar possíveis efeitos colaterais.
Suporte financeiroNenhum.
Contribuição dos autoresLeonie Frommherz: Obteve e analisou os dados e redigiu o manuscrito.
Markus Reinholz: Obteve e analisou os dados e redigiu o manuscrito.
Anne Gürtler: Obteve dados, revisou‐os e fez a revisão do manuscrito.
Pia‐Charlotte Stadler: Obteve dados, revisou‐os e fez a revisão do manuscrito.
Till Kaemmerer: Obteve dados, revisou‐os e fez a revisão do manuscrito.
Lars French: Obteve dados, revisou‐os e fez a revisão do manuscrito.
Benjamin M. Clanner‐Engelshofen: Obteve e analisou os dados e redigiu o manuscrito.
Conflito de interessesNenhum.
Como citar este artigo: Frommherz L, Reinholz M, Gürtler A, Stadler PC, Kaemmerer T, French L, et al. High‐frequency devices effect in vitro: promising approach in the treatment of acne vulgaris? An Bras Dermatol. 2022;97:729–34.
Trabalho realizado no Departamento de Dermatologia e Alergia, University Hospital, Ludwig Maximilian University, Munique, Alemanha.
