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n&#237;veis elevados do supressor tumoral p53&#44; do inibidor de quinase dependente de ciclina &#40;CDK&#41; p21 e da prote&#237;na marcadora de senesc&#234;ncia 30 &#40;SMP30&#41;&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">4&#44;5</span></a> V&#225;rios estudos indicaram que o estresse oxidativo contribui para o envelhecimento da pele e danos d&#233;rmicos&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">6</span></a> O estresse oxidativo &#233; um processo fisiol&#243;gico resultante de esp&#233;cies reativas de oxig&#234;nio &#40;ROS&#44; <span class="elsevierStyleItalic">reactive oxygen species</span>&#41;&#44; ou de esp&#233;cies reativas de nitrog&#234;nio&#44; incluindo o per&#243;xido de hidrog&#234;nio &#40;H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#41; e o &#226;nion super&#243;xido &#40;O<span class="elsevierStyleSup">2&#8722;</span>&#41;&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a> A pele tem um sistema de defesa antioxidante&#44; incluindo os antioxidantes enzim&#225;ticos como super&#243;xido dismutase &#40;SOD&#41;&#44; glutationa peroxidase &#40;GPx&#41; e catalase &#40;CAT&#41;&#44; que ajudam a eliminar o excesso de ROS&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0220"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a> O SOD converte O<span class="elsevierStyleSup">2&#8211;</span> em H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#44; enquanto GPx e CAT convertem H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> em &#225;gua&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0225"><span class="elsevierStyleSup">9&#44;10</span></a></p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">J&#225; foi elucidado que os microRNAs &#40;miRNAs&#41;&#44; RNAs n&#227;o codificantes end&#243;genos de 18 a 24 nucleot&#237;deos&#44; est&#227;o implicados em uma variedade de processos biol&#243;gicos&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0235"><span class="elsevierStyleSup">11&#44;12</span></a> Os miRNAs podem se ligar a regi&#245;es n&#227;o traduzidas em 3&#8217; &#40;3&#8217;UTRs&#41; do RNA mensageiro &#40;mRNA&#41; e regulam a express&#227;o g&#234;nica p&#243;s&#8208;transcricional&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a> M&#250;ltiplos miRNAs t&#234;m sido indicados como desempenhando papel importante na senesc&#234;ncia celular cut&#226;nea&#46; Por exemplo&#44; o miR&#8208;217 facilita a senesc&#234;ncia em fibroblastos da pele humana ligando&#8208;se &#224; DNA metiltransferase 1 &#40;DNMT1&#41;&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0250"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a> O miR&#8208;20a&#8208;3p &#233; superexpresso em fibroblastos senescentes e leva &#224; senesc&#234;ncia celular ao ter como alvo HAS2&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">15</span></a> &#201; importante ressaltar que o miR&#8208;181a tamb&#233;m demonstrou estar envolvido na senesc&#234;ncia celular&#46; Por exemplo&#44; o miR&#8208;181a &#233; sobrerregulado durante a senesc&#234;ncia de fibroblastos d&#233;rmicos humanos&#44; o que subsequentemente induz a senesc&#234;ncia celular em c&#233;lulas de passagem inicial&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a> Al&#233;m disso&#44; o miR&#8208;181a sub&#8208;regulado demonstrou atenuar o estresse oxidativo na les&#227;o mioc&#225;rdica pela intera&#231;&#227;o com XIAP&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0265"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> Entretanto&#44; o mecanismo potencial do miR&#8208;181a na senesc&#234;ncia celular induzida por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> n&#227;o est&#225; esclarecido&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A prote&#237;na dissulfeto isomerase fam&#237;lia A membro 6 &#40;PDIA6&#44; tamb&#233;m conhecida como P5&#41; catalisa o enovelamento de prote&#237;nas e exibe atividades de isomerase e chaperona&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a> Curiosamente&#44; um estudo anterior demonstrou que PDIA6 &#233; sub&#8208;regulada durante a senesc&#234;ncia celular em c&#233;lulas&#8208;tronco mesenquimais da medula &#243;ssea &#40;CTMMO&#41;&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">19</span></a> Al&#233;m disso&#44; a PDIA6&#44; localizada nas mitoc&#244;ndrias&#44; demonstrou inibir a morte celular causada pelo estresse oxidativo&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0280"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a> No entanto&#44; ainda &#233; desconhecido se a PDIA6 exerce efeito na senesc&#234;ncia celular induzida por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> em fibroblastos do prep&#250;cio humano &#40;FPH&#41;&#46;</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">No presente estudo&#44; os autores objetivam explorar o papel e o mecanismo do miR&#8208;181a subjacente ao estresse oxidativo induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> e &#224; senesc&#234;ncia celular em FPH&#46; Os resultados podem ajudar a desenvolver uma nova perspectiva para melhorar o envelhecimento da pele&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Materiais e m&#233;todos</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0055">Cultura de c&#233;lulas</span><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">FPH obtidos do banco de c&#233;lulas da Chinese Academy of Sciences &#40;Xangai&#44; China&#41; foram incubados em meio de Eagle modificado por Dulbecco &#40;DMEM&#44; Invitrogen&#44; Carlsbad&#44; CA&#44; EUA&#41; contendo 10&#37; de soro fetal bovino &#40;FBS&#59; Gibco&#44; Grand Island&#44; NY&#44; EUA&#41; e piruvato de s&#243;dio a 1&#37; &#40;Invitrogen&#41; em incubadora umidificada a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C com 5&#37; de CO<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#46; Ap&#243;s crescerem at&#233; 80&#37; de conflu&#234;ncia&#44; as c&#233;lulas na fase logar&#237;tmica de crescimento foram inoculadas em placas de 96 po&#231;os &#40;104 c&#233;lulas&#47;po&#231;o&#41; e cultivadas por mais 24 horas&#46; Em seguida&#44; o meio de cultura foi removido e substitu&#237;do por DMEM contendo 1&#37; de FBS&#46; Ap&#243;s 24 horas de incuba&#231;&#227;o&#44; 0 ou 200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M de H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> foi adicionado ao meio e mantido por 6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h para estabelecer FPH de controle ou FPH induzidos por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#46; Todos os experimentos foram realizados em triplicata&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0060">Transfec&#231;&#227;o de c&#233;lulas</span><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O inibidor de miR&#8208;181a e o miR&#8208;NC foram adquiridos da GenePharma &#40;Xangai&#44; China&#41; e foram transfectados em FPH &#40;50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nM&#41; para inibir o miR&#8208;181a&#46; RNA de <span class="elsevierStyleItalic">hairpin</span> curto atuando especificamente sobre a PDIA6 &#40;sh&#8208;PDIA6&#41; e sh&#8208;NC de controle tamb&#233;m adquiridos da GenePharma foram transfectados em FPH &#40;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;g&#47;&#956;L&#41; para sub&#8208;regula&#231;&#227;o de PDIA6&#46; A transfec&#231;&#227;o celular foi realizada com lipofectamina 2000 &#40;Invitrogen&#41; seguindo as recomenda&#231;&#245;es do fabricante&#46; Ap&#243;s 48 horas&#44; a efici&#234;ncia de transfec&#231;&#227;o foi avaliada por RT&#8208;qPCR&#46; Todos os experimentos foram realizados em triplicata&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Ensaio de Contagem de c&#233;lulas kit&#8208; 8&#40;CCK&#8208; 8&#41;</span><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Ap&#243;s tratamento com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> e&#47;ou indica&#231;&#227;o de transfec&#231;&#227;o&#44; 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;L de solu&#231;&#227;o de CCK&#8208;8 &#40;Dojindo&#44; Kumamoto&#44; Jap&#227;o&#41; foram adicionados ao meio e os FPH foram cultivados a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C por mais 2 horas&#46; Em seguida&#44; um leitor de microplacas &#40;Molecular Devices&#44; Xangai&#44; China&#41; foi utilizado para medir a absorb&#226;ncia em 450<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm de acordo com as instru&#231;&#245;es do fabricante&#46; Todos os experimentos foram realizados em triplicata&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Rea&#231;&#227;o em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa &#40;qRT&#8208;PCR&#41;</span><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O RNA total foi isolado de FPH usando reagente TRIzol &#40;Invitrogen&#41;&#46; A s&#237;ntese de cDNA foi alcan&#231;ada por transcri&#231;&#227;o reversa de RNA total usando o kit de reagentes PrimeScript<span class="elsevierStyleSup">TM</span> RT &#40;Takara&#44; Dalian&#44; China&#41;&#46; A RT&#8208;qPCR foi realizada utilizando SYBR&#174; Premix Ex Taq&#8482; II &#40;Takara&#41; em sistema de tempo real CFX96&#8482; &#40;Bio&#8208;Rad&#44; Hercules&#44; CA&#44; EUA&#41;&#46; Os n&#237;veis de express&#227;o relativa de miR&#8208;181a e seus alvos <span class="elsevierStyleItalic">downstream</span> foram calculados com o m&#233;todo 2<span class="elsevierStyleSup">&#8211;&#916;&#916;Ct</span>&#44; com U6 e GAPDH como normaliza&#231;&#227;o&#44; respectivamente&#46; Todos os experimentos foram realizados em triplicata&#46; As sequ&#234;ncias de primers est&#227;o listadas na <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabela 1</a>&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Western blotting</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Os FPH foram lisados em tamp&#227;o RIPA &#40;Cell Signaling&#44; Danvers&#44; MA&#44; EUA&#41; e a concentra&#231;&#227;o de prote&#237;nas foi medida por um kit BCA &#40;Bio&#8208;Rad&#41;&#46; Amostras de prote&#237;na &#40;20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;g&#41; foram separadas por gel SDS&#8208;PAGE a 10&#37;&#44; transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno &#40;PVDF&#59; Millipore&#44; Billerica&#44; MA&#44; EUA&#41; e bloqueadas com leite desnatado a 5&#37;&#46; Em seguida&#44; as membranas foram incubadas a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante a noite com anticorpos prim&#225;rios da seguinte forma&#58; anti&#8208;p21 &#40;ab109520&#44; 1&#58;1000&#41;&#44; anti&#8208;p53 &#40;ab32389&#44; 1&#58;10000&#41;&#44; anti&#8208;SMP30 &#40;ab233007&#44; 1&#58;400&#41;&#44; anti&#8208;beta&#8208;actin &#40;ab115777&#44; 1&#58;200&#41;&#44; anti&#8208;PDIA6 &#40;ab154820&#44; 1&#58;1000&#41;&#59; todos da Abcam&#44; Cambridge&#44; MA&#44; EUA&#41; seguido de incuba&#231;&#227;o com anticorpo secund&#225;rio &#40;ab97080&#44; Abcam&#41; por 1 hora em temperatura ambiente&#46; A beta&#8208;actina foi usada como controle de carga&#46; As prote&#237;nas foram analisadas com um sistema ECL &#40;Bio&#8208;Rad&#41; e quantificadas pelo software ImageJ &#40;National Institutes of Health&#44; Bethesda&#44; MD&#44; EUA&#41;&#46; Todos os experimentos foram realizados em triplicata&#46;</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Colora&#231;&#227;o de SA&#8208;&#946;&#8208;gal</span><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Os FPH foram lavados com PBS&#44; fixados em formalde&#237;do a 3&#37; na temperatura ambiente por 15 minutos&#46; Ap&#243;s a lavagem com PBS duas vezes&#44; os FPH foram incubados durante a noite a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C com os corantes para &#946;&#8208;galactosidase &#40;1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg&#47;mL X&#8208;gal&#44; 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM MgCl<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#44; 150<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM NaCl&#44; pH 6&#44;0&#44; 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de ferrocianeto de pot&#225;ssio&#44; 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de ferricianeto de pot&#225;ssio e 40<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nM de &#225;cido c&#237;trico&#47;fosfato de s&#243;dio&#58; Beyotime&#44; Xangai&#44; China&#41;&#46; Subsequentemente&#44; os FPH corados foram observados em um microsc&#243;pio &#243;ptico &#40;Nikon&#44; T&#243;quio&#44; Jap&#227;o&#41; com aumento de 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#215;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>e a porcentagem de c&#233;lulas positivas foi determinada com o software Image&#8208;Pro Plus 6&#46;0 &#40;Media Cybernetics&#44; Silver Spring&#44; MD&#44; EUA&#41;&#46; Todos os experimentos foram realizados em triplicata&#46;</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Detec&#231;&#227;o de atividades de SOD&#44; GPx e CAT</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As atividades de SOD&#44; GPx e CAT foram medidas conforme descrito anteriormente&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0285"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a> Resumidamente&#44; uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima que suprimiu 50&#37; do formazan&#47;min&#46; A xantina e a xantina oxidase foram utilizadas para produzir &#226;nions super&#243;xido&#46; A rea&#231;&#227;o entre &#226;nions super&#243;xido e cloreto tetrass&#243;dico formou formazan amarelo&#44; cuja absor&#231;&#227;o foi avaliada em 450<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm&#46; Para GPx&#44; as rea&#231;&#245;es enzim&#225;ticas em tubos contendo glutationa reduzida&#44; glutationa redutase e NADPH&#44; foram iniciadas pela adi&#231;&#227;o de hidroper&#243;xido de cumeno&#46; A atividade de GPx foi medida em comprimento de onda de 340<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm&#46; Para a atividade de CAT&#44; uma unidade de CAT foi definida como a quantidade de enzima que decomp&#244;s 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M de H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#47;min&#46; A taxa de decomposi&#231;&#227;o de H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> foi avaliada a 570<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm&#46; Os kits de ensaio SOD&#44; GPx e CAT &#40;Jiancheng Bioengineering Institute&#44; Nanjing&#44; China&#41; foram usados para detectar espectrofotometricamente as atividades enzim&#225;ticas que foram expressas em U&#47;mg de prote&#237;na&#46; Todos os experimentos foram realizados em triplicata&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Ensaio relator de luciferase</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O s&#237;tio de liga&#231;&#227;o complementar de miR&#8208;181a em PDIA6 3&#8217;UTR foi previsto pelo TargetScan &#40;<a href="http://www.targetscan.org/vert_71/">http&#58;&#47;&#47;www&#46;targetscan&#46;org&#47;vert&#95;71&#47;</a>&#41;&#46; As sequ&#234;ncias de tipo selvagem ou mutantes de PDIA6 3&#8217;UTR foram subclonadas em vetores pmirGLO &#40;Promega&#44; Madison&#44; WI&#44; EUA&#41; para estabelecer PDIA6&#8208;Wt&#47;Mut&#46; Posteriormente&#44; esses vetores foram cotransfectados em FPH com inibidor de miR&#8208;181a ou miR&#8208;NC usando Lipofectamine 2000 &#40;Invitrogen&#41;&#46; Ap&#243;s 48 horas de transfec&#231;&#227;o&#44; a atividade da luciferase foi avaliada utilizando&#8208;se um kit relator dual&#8208;luciferase &#40;Promega&#41;&#44; normalizado para a atividade da luciferase Renilla&#46; Todos os experimentos foram realizados em triplicata&#46;</p></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">An&#225;lise estat&#237;stica</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O software SPSS 18&#46;0 &#40;SPSS&#44; Chicago&#44; IL&#44; EUA&#41; foi utilizado para a an&#225;lise estat&#237;stica&#46; Os dados s&#227;o apresentados como m&#233;dia<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>desvio padr&#227;o&#46; As diferen&#231;as entre dois grupos foram analisadas pelo teste <span class="elsevierStyleItalic">t</span> de Student&#44; enquanto aquelas entre mais de dois grupos foram avaliadas pela an&#225;lise de vari&#226;ncia &#40;ANOVA&#41; seguida pela an&#225;lise <span class="elsevierStyleItalic">post&#8208;hoc</span> de Tukey&#46; Cada experimento foi repetido pelo menos tr&#234;s vezes&#46; O valor de p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;05 foi considerado significativo&#46;</p></span></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Resultados</span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">A sub&#8208;regula&#231;&#227;o do miR&#8208;181a atenua a senesc&#234;ncia celular induzida por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> e o estresse oxidativo</span><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Primeiro&#44; foi detectado o n&#237;vel de miR&#8208;181a em FPH por RT&#8208;qPCR&#46; Em rela&#231;&#227;o ao grupo controle&#44; o n&#237;vel de miR&#8208;181a estava aumentado em FPH tratados com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> e estava reduzido ap&#243;s a transfec&#231;&#227;o do inibidor de miR&#8208;181a &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>A&#41;&#46; Em seguida&#44; foi avaliado o impacto de miR&#8208;181a na viabilidade dos FPH&#46; Como revelado pelo ensaio CCK&#8208;8&#44; o tratamento com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> reduziu acentuadamente a viabilidade dos FPH&#44; enquanto a deple&#231;&#227;o de miR&#8208;181a atenuou esse efeito &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>B&#41;&#44; sugerindo que miR&#8208;181a sub&#8208;regulado pode proteger FPH contra danos celulares induzidos por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#46; Al&#233;m disso&#44; a detec&#231;&#227;o da atividade de SA&#8208;&#946;&#8208;gal mostrou que a inibi&#231;&#227;o de miR&#8208;181a levou a uma redu&#231;&#227;o no aumento da porcentagem de c&#233;lulas positivas para SA&#8208;&#946;&#8208;gal induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>C&#41;&#46; Tend&#234;ncia semelhante foi observada nos resultados de <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span>&#46; Os n&#237;veis de prote&#237;na dos marcadores de senesc&#234;ncia &#40;p21&#44; p53 e SMP30&#41; foram significativamente aumentados pelo tratamento com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> em FPH em compara&#231;&#227;o com os grupos controle e foram ent&#227;o diminu&#237;dos pelo inibidor de miR&#8208;181a &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>D&#63;G&#41;&#46; Os resultados acima indicaram que miR&#8208;181a sub&#8208;regulado atenua a senesc&#234;ncia celular induzida por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> em FPH&#46; Posteriormente&#44; foi testado se o miR&#8208;181a tem impacto no estresse oxidativo induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#46; Como mostrado na <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a>H&#8211;J&#44; o tratamento com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> elevou acentuadamente as atividades de SOD&#44; GPx e CAT&#44; que foram parcialmente revertidas ap&#243;s a sub&#8208;regula&#231;&#227;o de miR&#8208;181a em FPH&#46; Os resultados sugeriram que as enzimas antioxidantes respondem ativamente ao estresse oxidativo e a inibi&#231;&#227;o do miR&#8208;181a pode aliviar o estresse oxidativo induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">MiR&#8208;181a atua sobre PDIA6</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Como mostrado na <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a>A&#44; quatro alvos <span class="elsevierStyleItalic">downstream</span> de miR&#8208;181a foram selecionados pela ferramenta de bioinform&#225;tica ENCORI &#40;<a href="https://starbase.sysu.edu.cn/">https&#58;&#47;&#47;starbase&#46;sysu&#46;edu&#46;cn&#47;</a>&#41; com a condi&#231;&#227;o de n&#250;mero de experimentos AGO CLIP&#8208;seq suportados &#40;AgoExpNum&#41; &#8805; 40&#46; Os resultados da RT&#8208;qPCR mostraram que ap&#243;s a inibi&#231;&#227;o de miR&#8208;181a em FPH&#44; apenas o n&#237;vel de PDIA6 foi significativamente aumentado &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>B&#41;&#46; Da mesma maneira&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span> mostrou que o inibidor de miR&#8208;181a aumentou o n&#237;vel de prote&#237;na de PDIA6 em FPH &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>C&#41;&#46; A exist&#234;ncia de um s&#237;tio putativo complementar entre miR&#8208;181a e PDIA6 foi prevista por TargetScan &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>D&#41;&#46; Al&#233;m disso&#44; a atividade de luciferase de PDIA6&#8208;Wt foi sobrerregulada em FPH ap&#243;s a transfec&#231;&#227;o do inibidor de miR&#8208;181a&#44; enquanto a de PDIA6&#8208;Mut n&#227;o foi significativamente influenciada&#44; como mostrado pelo ensaio relator de luciferase &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>E&#41;&#46; Notavelmente&#44; a RT&#8208;qPCR e o <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span> demonstraram que o mRNA e a express&#227;o de prote&#237;na de PDIA6 foram acentuadamente sub&#8208;regulados em FPH tratados com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> em compara&#231;&#227;o com o grupo controle &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>F&#8211;H&#41;&#46; Coletivamente&#44; PDIA6 &#233; um alvo para miR&#8208;181a em FPH&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">O knockdown de PDIA6 reverte o impacto supressivo mediado pela inibi&#231;&#227;o de miR&#8208;181a na senesc&#234;ncia celular e no estresse oxidativo</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para investigar o impacto de PDIA6 na senesc&#234;ncia celular em FPH&#44; primeiro os autores transfectaram sh&#8208;PDIA6 em FPH&#46; Os n&#237;veis de mRNA e de express&#227;o da prote&#237;na PDIA6 foram diminu&#237;dos em FPH transfectados com sh&#8208;PDIA6&#44; como demonstrado por RT&#8208;qPCR e <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span>&#44; respectivamente &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3</a>A&#8211;C&#41;&#46; O ensaio CCK&#8208;8 revelou que o inibidor de miR&#8208;181a promoveu a viabilidade de FPH enquanto a cotransfec&#231;&#227;o de sh&#8208;PDIA6 atenuou esse efeito &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3</a>D&#41;&#46; Al&#233;m disso&#44; os resultados da colora&#231;&#227;o para SA&#8208;&#946;&#8208;gal mostraram que a deple&#231;&#227;o de miR&#8208;181a reduziu significativamente a porcentagem de c&#233;lulas positivas para SA&#8208;&#946;&#8208;gal&#44; que foi parcialmente revertida pelo <span class="elsevierStyleItalic">knockdown</span> de miR&#8208;181a e PDIA6 simultaneamente &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3</a>E&#8211;F&#41;&#46; Isso foi consistente com o <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span>&#44; que mostrou que o <span class="elsevierStyleItalic">knockdown</span> de PDIA6 resgatou a redu&#231;&#227;o nos n&#237;veis de prote&#237;na marcadora de senesc&#234;ncia causada pelo inibidor de miR&#8208;181a em FPH &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3</a>G&#8211;J&#41;&#46; Assim&#44; foi sugerido pelos resultados acima que miR&#8208;181a sub&#8208;regulado atenua a senesc&#234;ncia celular mediada por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#44; tendo como alvo PDIA6&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Em seguida&#44; os autores testaram se o miR&#8208;181a exerce sua influ&#234;ncia no estresse oxidativo regulando PDIA6&#46; Como demonstrado pelos resultados&#44; o <span class="elsevierStyleItalic">knockdown</span> de PDIA6 atenuou o efeito supressor nas atividades de SOD&#44; GPx e CAT em FPH resultante do inibidor de miR&#8208;181a &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3</a>K&#8211;M&#41;&#46; Isso revelou que o miR&#8208;181a sub&#8208;regulado atenua o estresse oxidativo induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> tendo como alvo PDIA6&#46;</p></span></span><span id="sec0080" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Discuss&#227;o</span><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O dano resultante da diminui&#231;&#227;o da capacidade antioxidante e do desequil&#237;brio do sistema oxidativo &#233; denominado estresse oxidativo&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0290"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a> Evid&#234;ncias emergentes t&#234;m sugerido que o estresse oxidativo na pele &#233; uma causa chave da senesc&#234;ncia celular&#44; consequentemente levando ao envelhecimento cut&#226;neo&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0295"><span class="elsevierStyleSup">23&#44;24</span></a> Estudos anteriores elucidaram o fato de que o envelhecimento e a exposi&#231;&#227;o a ultravioleta B &#40;UVB&#41; est&#227;o fortemente correlacionados com alto risco de c&#226;ncer de pele&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0305"><span class="elsevierStyleSup">25&#44;26</span></a> Sugere&#8208;se que uma quantidade aumentada de fibroblastos senescentes na pele geri&#225;trica cause o silenciamento da express&#227;o do fator de crescimento semelhante &#224; insulina 1 &#40;IGF&#8208;1&#44; <span class="elsevierStyleItalic">insulin&#8208;like growth factor 1</span>&#41; na pele&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0315"><span class="elsevierStyleSup">27</span></a> O silenciamento do IGF&#8208;1 em fibroblastos senescentes resulta em uma resposta UVB inadequada e prolifera&#231;&#227;o de queratin&#243;citos contendo danos no DNA&#44; o que acaba levando &#224; fotocarcinog&#234;nese&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0310"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a> Assim&#44; encontrar uma abordagem eficaz para atenuar a senesc&#234;ncia celular pode ajudar a reduzir o risco de c&#226;ncer cut&#226;neo&#46;</p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">V&#225;rios estudos demonstraram os efeitos significativos de miRNAs envolvidos no estresse oxidativo e senesc&#234;ncia celular&#44; como miR&#8208;1445&#8208;5p&#44; miR&#8208;570 e miR&#8208;93&#8208;5p&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0320"><span class="elsevierStyleSup">28&#8211;30</span></a> Estudos anteriores verificaram que miR&#8208;181a desempenha um papel crucial na senesc&#234;ncia celular&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0335"><span class="elsevierStyleSup">31</span></a> Foi relatado que o miR&#8208;181a exibe express&#227;o elevada em queratin&#243;citos durante a senesc&#234;ncia replicativa&#44; sugerindo que o miR&#8208;181a superexpresso pode desempenhar um papel promotor na senesc&#234;ncia celular&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0340"><span class="elsevierStyleSup">32</span></a> No presente estudo&#44; os autores avaliaram o papel do miR&#8208;181a em FPH tratados com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#46; As c&#233;lulas senescentes s&#227;o caracterizadas por interrup&#231;&#227;o do crescimento celular e express&#227;o g&#234;nica anormal&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0345"><span class="elsevierStyleSup">33</span></a> Assim&#44; o papel do miR&#8208;181a em FPH tratados com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> foi identificado pela detec&#231;&#227;o de sua influ&#234;ncia na viabilidade celular&#44; colora&#231;&#227;o para SA&#8208;&#946;&#8208;gal e n&#237;veis de express&#227;o de marcadores de senesc&#234;ncia&#46; Foi revelado que o miR&#8208;181a sub&#8208;regulado poderia aumentar a viabilidade celular e suprimir a senesc&#234;ncia celular causada por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> em FPH&#46; Al&#233;m disso&#44; para detectar o impacto do miR&#8208;181a no estresse oxidativo induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#44; foram avaliadas as atividades dos antioxidantes &#40;SOD&#44; GPx e CAT&#41; que s&#227;o os principais reguladores do sistema oxidativo&#46; Verificou&#8208;se que a inibi&#231;&#227;o de miR&#8208;181a diminuiu significativamente as habilidades antioxidantes em FPH tratados com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#44; indicando que o <span class="elsevierStyleItalic">knockdown</span> de miR&#8208;181a &#233; capaz de suprimir o estresse oxidativo induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#46;</p><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Os miRNAs s&#227;o conhecidos por modular a express&#227;o de alvos <span class="elsevierStyleItalic">downstream</span> por pareamento de bases nas sequ&#234;ncias de mRNA 3&#8217;UTRs&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0350"><span class="elsevierStyleSup">34</span></a> Para descobrir como o miR&#8208;181a exerce sua influ&#234;ncia no estresse oxidativo e na senesc&#234;ncia celular&#44; a ferramenta de bioinform&#225;tica ENCORI foi utilizada para rastrear os alvos <span class="elsevierStyleItalic">downstream</span> do miR&#8208;181a&#46; Entre os mRNAs selecionados&#44; finalmente identificou&#8208;se PDIA6 como o gene alvo do miR&#8208;181a&#46; PDIA6&#44; um membro da fam&#237;lia dissulfeto isomerase&#44; est&#225; implicado em v&#225;rias doen&#231;as humanas&#44; como diabetes <span class="elsevierStyleItalic">mellitus</span>&#44; fibrose hep&#225;tica e v&#225;rios tipos de c&#226;ncer&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0355"><span class="elsevierStyleSup">35&#44;36</span></a> Al&#233;m disso&#44; estudo anterior sugeriu que PDIA6 est&#225; intimamente relacionada &#224; senesc&#234;ncia celular em CTMMO humanas&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">19</span></a> No presente estudo&#44; PDIA6 apresentou express&#227;o diminu&#237;da em FPH tratados com H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> em compara&#231;&#227;o ao grupo controle&#46; Curiosamente&#44; a inibi&#231;&#227;o de miR&#8208;181a aliviou o estresse oxidativo induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> em FPH e a senesc&#234;ncia celular&#44; enquanto o <span class="elsevierStyleItalic">knockdown</span> de PDIA6 reverteu o impacto inibit&#243;rio na senesc&#234;ncia celular e no estresse oxidativo mediado por miR&#8208;181a sub&#8208;regulado&#46; Isso sugeriu que o silenciamento do miR&#8208;181a atenuou a senesc&#234;ncia celular e o estresse oxidativo induzidos por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> ao atuar sobre PDIA6&#44; e a PDIA6 pode proteger os FPH contra a senesc&#234;ncia celular induzida por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#46;</p></span><span id="sec0085" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">Conclus&#227;o</span><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O papel em potencial e o mecanismo do miR&#8208;181a na regula&#231;&#227;o do estresse oxidativo induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> e a senesc&#234;ncia celular em FPH foram investigados&#46; Os resultados revelaram que o miR&#8208;181a sub&#8208;regulado pode atenuar o estresse oxidativo induzido por H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> e a senesc&#234;ncia celular em FPH atrav&#233;s da regula&#231;&#227;o da PDIA6&#46; Os achados do presente estudo podem ajudar a desenvolver uma nova perspectiva para melhorar o envelhecimento da pele e os dist&#250;rbios associados &#224; senesc&#234;ncia&#46;</p></span><span id="sec0090" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">Suporte financeiro</span><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O estudo recebeu suporte financeiro do Projeto de Pesquisa em Ci&#234;ncias M&#233;dicas da Wuhan Municipal Health Commission &#40;concess&#227;o n&#176; WX20Q03&#41;&#46;</p></span><span id="sec0095" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0135">Contribui&#231;&#227;o dos autores</span><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Yan Huang&#58; Revis&#227;o cr&#237;tica da literatura&#59; obten&#231;&#227;o dos dados&#59; participa&#231;&#227;o efetiva na orienta&#231;&#227;o da pesquisa&#59; participa&#231;&#227;o intelectual em conduta proped&#234;utica e&#47;ou terap&#234;utica de casos estudados&#59; revis&#227;o cr&#237;tica do manuscrito&#59; elabora&#231;&#227;o e reda&#231;&#227;o do manuscrito&#59; an&#225;lise estat&#237;stica&#59; concep&#231;&#227;o e planejamento do estudo&#59; aprova&#231;&#227;o da vers&#227;o final do manuscrito&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Huimin Yan&#58; Revis&#227;o cr&#237;tica da literatura&#59; obten&#231;&#227;o&#44; an&#225;lise e interpreta&#231;&#227;o dos dados&#59; participa&#231;&#227;o efetiva na orienta&#231;&#227;o da pesquisa&#59; participa&#231;&#227;o intelectual em conduta proped&#234;utica e&#47;ou terap&#234;utica de casos estudados&#59; revis&#227;o cr&#237;tica do manuscrito&#59; elabora&#231;&#227;o e reda&#231;&#227;o do manuscrito&#59; an&#225;lise estat&#237;stica&#59; concep&#231;&#227;o e planejamento do estudo&#59; aprova&#231;&#227;o da vers&#227;o final do manuscrito&#46;</p><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Yanqing Yang&#58; Obten&#231;&#227;o&#44; an&#225;lise e interpreta&#231;&#227;o dos dados&#59; 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Journal Information
Vol. 98. Issue 1.
Pages 17-25 (1 January 2023)
Visits
3972
Vol. 98. Issue 1.
Pages 17-25 (1 January 2023)
Artigo original
Open Access
Sub‐regulação do miR‐181a atenua o estresse oxidativo induzido por H2O2 e a senescência celular atuando sobre PDIA6 em fibroblastos do prepúcio humano
Visits
3972
Yan Huanga, Huimin Yana, Yanqing Yanga, Jinfei Zhoub, Qijun Xua, Meng Hua,
Corresponding author
humeng7622@163.com

Autor para correspondência.
a Wuhan Third Hospital, Departamento de Cirurgia Plástica, Hubei, China
b Xiangyang Yilaimei Medical Beauty Clinic, Departamento de Dermatologia Estética, Hubei, China
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Resumo
Fundamentos

O estresse oxidativo está fortemente associado com a senescência celular. Vários estudos indicaram que os microRNAs (miRNAs) desempenham papel crítico na senescência celular. Foi relatado que o miR‐181a induz a senescência celular; entretanto, o mecanismo potencial do miR‐181a na senescência celular induzida por peróxido de hidrogênio (H2O2) permanece obscuro.

Objetivo

Investigar o papel e o mecanismo regulador do miR‐181a na senescência celular induzida por H2O2.

Métodos

Fibroblastos de prepúcio humano (FPH) transfectados com inibidor de miR‐181a/miR‐NC com ou sem tratamento com H2O2 foram divididos em quatro grupos: controle+miR‐NC/ inibidor de miR‐181a, H2O2+miR‐NC/ inibidor de miR‐181a. O ensaio CCK‐8 foi utilizado para avaliar a viabilidade dos FPH. RT‐qPCR foi usada para medir a expressão de miR‐181a e seus genes alvo. Os níveis da proteína dissulfeto isomerase família A membro 6 (PDIA6) e marcadores de senescência foram avaliados por Western blotting. A coloração para β‐galactosidase associada à senescência (SA‐β‐gal) foi empregada para detectar a atividade de SA‐β‐gal. As atividades de SOD, GPx e CAT foram detectadas pelos kits de ensaio correspondentes. A relação de ligação entre PDIA6 e miR‐181a foi identificada pelo ensaio relator de luciferase.

Resultados

A inibição do MiR‐181a suprimiu o estresse oxidativo induzido por H2O2 e a senescência celular em FPH. PDIA6 foi alvo de miR‐181a e pouco expressa em FPH tratados com H2O2. O knockdown de PDIA6 reverteu o impacto supressivo mediado pela inibição do miR‐181a no estresse oxidativo induzido por H2O2 e na senescência celular em FPH.

Limitações do estudo

As vias de sinalização que podem ser mediadas pelo eixo miR‐181a/PDIA6 não foram investigadas.

Conclusão

O miR‐181a sub‐regulado atenua o estresse oxidativo induzido por H2O2 e a senescência celular em FPH atuando sobre PDIA6.

Palavras‐chave:
Senescência celular
Estresse oxidativo
Isomerases de dissulfetos de proteínas
Full Text
Introdução

A senescência celular é um processo que consiste em uma parada de crescimento irreversível, considerada uma das características do envelhecimento.1 A senescência celular na pele leva ao envelhecimento cutâneo, que pode ser induzido por fatores extrínsecos e intrínsecos.2,3 Células senescentes podem ser detectadas por meio de muitas características, como atividade aumentada da β‐galactosidase associada à senescência (SA‐β‐gal), níveis elevados do supressor tumoral p53, do inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK) p21 e da proteína marcadora de senescência 30 (SMP30).4,5 Vários estudos indicaram que o estresse oxidativo contribui para o envelhecimento da pele e danos dérmicos.6 O estresse oxidativo é um processo fisiológico resultante de espécies reativas de oxigênio (ROS, reactive oxygen species), ou de espécies reativas de nitrogênio, incluindo o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o ânion superóxido (O2−).7 A pele tem um sistema de defesa antioxidante, incluindo os antioxidantes enzimáticos como superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e catalase (CAT), que ajudam a eliminar o excesso de ROS.8 O SOD converte O2– em H2O2, enquanto GPx e CAT convertem H2O2 em água.9,10

Já foi elucidado que os microRNAs (miRNAs), RNAs não codificantes endógenos de 18 a 24 nucleotídeos, estão implicados em uma variedade de processos biológicos.11,12 Os miRNAs podem se ligar a regiões não traduzidas em 3’ (3’UTRs) do RNA mensageiro (mRNA) e regulam a expressão gênica pós‐transcricional.13 Múltiplos miRNAs têm sido indicados como desempenhando papel importante na senescência celular cutânea. Por exemplo, o miR‐217 facilita a senescência em fibroblastos da pele humana ligando‐se à DNA metiltransferase 1 (DNMT1).14 O miR‐20a‐3p é superexpresso em fibroblastos senescentes e leva à senescência celular ao ter como alvo HAS2.15 É importante ressaltar que o miR‐181a também demonstrou estar envolvido na senescência celular. Por exemplo, o miR‐181a é sobrerregulado durante a senescência de fibroblastos dérmicos humanos, o que subsequentemente induz a senescência celular em células de passagem inicial.16 Além disso, o miR‐181a sub‐regulado demonstrou atenuar o estresse oxidativo na lesão miocárdica pela interação com XIAP.17 Entretanto, o mecanismo potencial do miR‐181a na senescência celular induzida por H2O2 não está esclarecido.

A proteína dissulfeto isomerase família A membro 6 (PDIA6, também conhecida como P5) catalisa o enovelamento de proteínas e exibe atividades de isomerase e chaperona.18 Curiosamente, um estudo anterior demonstrou que PDIA6 é sub‐regulada durante a senescência celular em células‐tronco mesenquimais da medula óssea (CTMMO).19 Além disso, a PDIA6, localizada nas mitocôndrias, demonstrou inibir a morte celular causada pelo estresse oxidativo.20 No entanto, ainda é desconhecido se a PDIA6 exerce efeito na senescência celular induzida por H2O2 em fibroblastos do prepúcio humano (FPH).

No presente estudo, os autores objetivam explorar o papel e o mecanismo do miR‐181a subjacente ao estresse oxidativo induzido por H2O2 e à senescência celular em FPH. Os resultados podem ajudar a desenvolver uma nova perspectiva para melhorar o envelhecimento da pele.

Materiais e métodosCultura de células

FPH obtidos do banco de células da Chinese Academy of Sciences (Xangai, China) foram incubados em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS; Gibco, Grand Island, NY, EUA) e piruvato de sódio a 1% (Invitrogen) em incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO2. Após crescerem até 80% de confluência, as células na fase logarítmica de crescimento foram inoculadas em placas de 96 poços (104 células/poço) e cultivadas por mais 24 horas. Em seguida, o meio de cultura foi removido e substituído por DMEM contendo 1% de FBS. Após 24 horas de incubação, 0 ou 200μM de H2O2 foi adicionado ao meio e mantido por 6h para estabelecer FPH de controle ou FPH induzidos por H2O2. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Transfecção de células

O inibidor de miR‐181a e o miR‐NC foram adquiridos da GenePharma (Xangai, China) e foram transfectados em FPH (50nM) para inibir o miR‐181a. RNA de hairpin curto atuando especificamente sobre a PDIA6 (sh‐PDIA6) e sh‐NC de controle também adquiridos da GenePharma foram transfectados em FPH (2μg/μL) para sub‐regulação de PDIA6. A transfecção celular foi realizada com lipofectamina 2000 (Invitrogen) seguindo as recomendações do fabricante. Após 48 horas, a eficiência de transfecção foi avaliada por RT‐qPCR. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Ensaio de Contagem de células kit‐ 8(CCK‐ 8)

Após tratamento com H2O2 e/ou indicação de transfecção, 10μL de solução de CCK‐8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) foram adicionados ao meio e os FPH foram cultivados a 37°C por mais 2 horas. Em seguida, um leitor de microplacas (Molecular Devices, Xangai, China) foi utilizado para medir a absorbância em 450nm de acordo com as instruções do fabricante. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (qRT‐PCR)

O RNA total foi isolado de FPH usando reagente TRIzol (Invitrogen). A síntese de cDNA foi alcançada por transcrição reversa de RNA total usando o kit de reagentes PrimeScriptTM RT (Takara, Dalian, China). A RT‐qPCR foi realizada utilizando SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara) em sistema de tempo real CFX96™ (Bio‐Rad, Hercules, CA, EUA). Os níveis de expressão relativa de miR‐181a e seus alvos downstream foram calculados com o método 2–ΔΔCt, com U6 e GAPDH como normalização, respectivamente. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. As sequências de primers estão listadas na tabela 1.

Tabela 1.

Sequências de primers utilizadas na RT‐qPCR

Gene  Sequência (5’-->3’) 
hsa‐miR‐181a‐5p forward  ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTCGG 
hsa‐miR‐181a‐5p reverse  TGGTGTCGTGGAGTCGA 
PDIA6 forward  TCCTGCCCACTCCCTATCAA 
PDIA6 reverse  GAACTGTATCCTCCGCTCCG 
TNPO1 forward  GACGCGCCTACGGGA 
TNPO1 reverse  TGTTGCACGGTTCTCTGGA 
HMGB2 forward  GCCAACAGGCTCAAAGAA 
HMGB2 reverse  CACACATTCCACACGCA 
CBX4 forward  TGGAGTATCTGGTGAAATGGA 
CBX4 reverse  ACGACGGGCAAAGGTAGGCAC 
GAPDH forward  TGCACCACCAACTGCTTAGC 
GAPDH reverse  GGCATGGACTGTGGTCATGAG 
U6 forward  CTCGCTTGGGCAGCACA 
U6 reverse  AACGCTTCACGAATTTGCGT 
Western blotting

Os FPH foram lisados em tampão RIPA (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA) e a concentração de proteínas foi medida por um kit BCA (Bio‐Rad). Amostras de proteína (20μg) foram separadas por gel SDS‐PAGE a 10%, transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF; Millipore, Billerica, MA, EUA) e bloqueadas com leite desnatado a 5%. Em seguida, as membranas foram incubadas a 4°C durante a noite com anticorpos primários da seguinte forma: anti‐p21 (ab109520, 1:1000), anti‐p53 (ab32389, 1:10000), anti‐SMP30 (ab233007, 1:400), anti‐beta‐actin (ab115777, 1:200), anti‐PDIA6 (ab154820, 1:1000); todos da Abcam, Cambridge, MA, EUA) seguido de incubação com anticorpo secundário (ab97080, Abcam) por 1 hora em temperatura ambiente. A beta‐actina foi usada como controle de carga. As proteínas foram analisadas com um sistema ECL (Bio‐Rad) e quantificadas pelo software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Coloração de SA‐β‐gal

Os FPH foram lavados com PBS, fixados em formaldeído a 3% na temperatura ambiente por 15 minutos. Após a lavagem com PBS duas vezes, os FPH foram incubados durante a noite a 37°C com os corantes para β‐galactosidase (1mg/mL X‐gal, 2mM MgCl2, 150mM NaCl, pH 6,0, 5mM de ferrocianeto de potássio, 5mM de ferricianeto de potássio e 40nM de ácido cítrico/fosfato de sódio: Beyotime, Xangai, China). Subsequentemente, os FPH corados foram observados em um microscópio óptico (Nikon, Tóquio, Japão) com aumento de 50×e a porcentagem de células positivas foi determinada com o software Image‐Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA). Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Detecção de atividades de SOD, GPx e CAT

As atividades de SOD, GPx e CAT foram medidas conforme descrito anteriormente.21 Resumidamente, uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima que suprimiu 50% do formazan/min. A xantina e a xantina oxidase foram utilizadas para produzir ânions superóxido. A reação entre ânions superóxido e cloreto tetrassódico formou formazan amarelo, cuja absorção foi avaliada em 450nm. Para GPx, as reações enzimáticas em tubos contendo glutationa reduzida, glutationa redutase e NADPH, foram iniciadas pela adição de hidroperóxido de cumeno. A atividade de GPx foi medida em comprimento de onda de 340nm. Para a atividade de CAT, uma unidade de CAT foi definida como a quantidade de enzima que decompôs 1M de H2O2/min. A taxa de decomposição de H2O2 foi avaliada a 570nm. Os kits de ensaio SOD, GPx e CAT (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) foram usados para detectar espectrofotometricamente as atividades enzimáticas que foram expressas em U/mg de proteína. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Ensaio relator de luciferase

O sítio de ligação complementar de miR‐181a em PDIA6 3’UTR foi previsto pelo TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/). As sequências de tipo selvagem ou mutantes de PDIA6 3’UTR foram subclonadas em vetores pmirGLO (Promega, Madison, WI, EUA) para estabelecer PDIA6‐Wt/Mut. Posteriormente, esses vetores foram cotransfectados em FPH com inibidor de miR‐181a ou miR‐NC usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Após 48 horas de transfecção, a atividade da luciferase foi avaliada utilizando‐se um kit relator dual‐luciferase (Promega), normalizado para a atividade da luciferase Renilla. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Análise estatística

O software SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para a análise estatística. Os dados são apresentados como média±desvio padrão. As diferenças entre dois grupos foram analisadas pelo teste t de Student, enquanto aquelas entre mais de dois grupos foram avaliadas pela análise de variância (ANOVA) seguida pela análise post‐hoc de Tukey. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. O valor de p<0,05 foi considerado significativo.

ResultadosA sub‐regulação do miR‐181a atenua a senescência celular induzida por H2O2 e o estresse oxidativo

Primeiro, foi detectado o nível de miR‐181a em FPH por RT‐qPCR. Em relação ao grupo controle, o nível de miR‐181a estava aumentado em FPH tratados com H2O2 e estava reduzido após a transfecção do inibidor de miR‐181a (fig. 1A). Em seguida, foi avaliado o impacto de miR‐181a na viabilidade dos FPH. Como revelado pelo ensaio CCK‐8, o tratamento com H2O2 reduziu acentuadamente a viabilidade dos FPH, enquanto a depleção de miR‐181a atenuou esse efeito (fig. 1B), sugerindo que miR‐181a sub‐regulado pode proteger FPH contra danos celulares induzidos por H2O2. Além disso, a detecção da atividade de SA‐β‐gal mostrou que a inibição de miR‐181a levou a uma redução no aumento da porcentagem de células positivas para SA‐β‐gal induzido por H2O2 (fig. 1C). Tendência semelhante foi observada nos resultados de Western blotting. Os níveis de proteína dos marcadores de senescência (p21, p53 e SMP30) foram significativamente aumentados pelo tratamento com H2O2 em FPH em comparação com os grupos controle e foram então diminuídos pelo inibidor de miR‐181a (fig. 1D?G). Os resultados acima indicaram que miR‐181a sub‐regulado atenua a senescência celular induzida por H2O2 em FPH. Posteriormente, foi testado se o miR‐181a tem impacto no estresse oxidativo induzido por H2O2. Como mostrado na figura 1H–J, o tratamento com H2O2 elevou acentuadamente as atividades de SOD, GPx e CAT, que foram parcialmente revertidas após a sub‐regulação de miR‐181a em FPH. Os resultados sugeriram que as enzimas antioxidantes respondem ativamente ao estresse oxidativo e a inibição do miR‐181a pode aliviar o estresse oxidativo induzido por H2O2.

Figura 1.

A depleção de MiR‐181a atenua a senescência celular induzida por H2O2 e o estresse oxidativo. Os ensaios foram conduzidos em FPH com diferentes tratamentos (com ou sem H2O2; transfecção de miR‐NC ou inibidor de miR‐181a). (A) Análise de RT‐qPCR do nível de miR‐181a. (B) Ensaio CCK‐8 para avaliar a viabilidade celular. (C) Coloração para SA‐β‐gal para avaliar a atividade de SA‐β‐gal. As imagens das células foram fotografadas com aumento de 50×. (D–G) Western blotting foi utilizado para medir os níveis de proteínas dos marcadores de senescência. (H–J) Mensuração das atividades de SOD, GPx e CAT nos FPH. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

(0.82MB).
MiR‐181a atua sobre PDIA6

Como mostrado na figura 2A, quatro alvos downstream de miR‐181a foram selecionados pela ferramenta de bioinformática ENCORI (https://starbase.sysu.edu.cn/) com a condição de número de experimentos AGO CLIP‐seq suportados (AgoExpNum) ≥ 40. Os resultados da RT‐qPCR mostraram que após a inibição de miR‐181a em FPH, apenas o nível de PDIA6 foi significativamente aumentado (fig. 2B). Da mesma maneira, Western blotting mostrou que o inibidor de miR‐181a aumentou o nível de proteína de PDIA6 em FPH (fig. 2C). A existência de um sítio putativo complementar entre miR‐181a e PDIA6 foi prevista por TargetScan (fig. 2D). Além disso, a atividade de luciferase de PDIA6‐Wt foi sobrerregulada em FPH após a transfecção do inibidor de miR‐181a, enquanto a de PDIA6‐Mut não foi significativamente influenciada, como mostrado pelo ensaio relator de luciferase (fig. 2E). Notavelmente, a RT‐qPCR e o Western blotting demonstraram que o mRNA e a expressão de proteína de PDIA6 foram acentuadamente sub‐regulados em FPH tratados com H2O2 em comparação com o grupo controle (fig. 2F–H). Coletivamente, PDIA6 é um alvo para miR‐181a em FPH.

Figura 2.

MiR‐181a liga‐se a PDIA6. (A) Quatro alvos downstream de miR‐181a previstos pela ferramenta de bioinformática ENCORI. (B) Análise de RT‐qPCR para avaliar esses níveis de mRNA em FPH transfectados com inibidor de miR‐181a. (C) Western blotting da expressão da proteína PDIA6 em FPH transfectados com inibidor de miR‐181a. (D) O sítio de ligação de miR‐181a na 3’UTR de PDIA6 previsto pelo TargetScan. (E) Ensaio relator de luciferase para elucidar a relação de ligação entre PDIA6 e miR‐181a. (F) Análise de RT‐qPCR do nível de PDIA6 em FPH tratados com H2O2. (G‐H) Western blotting do nível de proteína PDIA6 em FPH tratados com H2O2 e grupo controle. **p<0,01, ***p<0,001.

(0.52MB).
O knockdown de PDIA6 reverte o impacto supressivo mediado pela inibição de miR‐181a na senescência celular e no estresse oxidativo

Para investigar o impacto de PDIA6 na senescência celular em FPH, primeiro os autores transfectaram sh‐PDIA6 em FPH. Os níveis de mRNA e de expressão da proteína PDIA6 foram diminuídos em FPH transfectados com sh‐PDIA6, como demonstrado por RT‐qPCR e Western blotting, respectivamente (fig. 3A–C). O ensaio CCK‐8 revelou que o inibidor de miR‐181a promoveu a viabilidade de FPH enquanto a cotransfecção de sh‐PDIA6 atenuou esse efeito (fig. 3D). Além disso, os resultados da coloração para SA‐β‐gal mostraram que a depleção de miR‐181a reduziu significativamente a porcentagem de células positivas para SA‐β‐gal, que foi parcialmente revertida pelo knockdown de miR‐181a e PDIA6 simultaneamente (fig. 3E–F). Isso foi consistente com o Western blotting, que mostrou que o knockdown de PDIA6 resgatou a redução nos níveis de proteína marcadora de senescência causada pelo inibidor de miR‐181a em FPH (fig. 3G–J). Assim, foi sugerido pelos resultados acima que miR‐181a sub‐regulado atenua a senescência celular mediada por H2O2, tendo como alvo PDIA6.

Figura 3.

O knockdown de PDIA6 reverte o impacto supressivo mediado pelo inibidor de miR‐181a na senescência celular e no estresse oxidativo. (A) Análise de RT‐qPCR da expressão de PDIA6 em FPH transfectados com sh‐PDIA6. (B–C) Western blotting da expressão da proteína PDIA6 em FPH transfectados. (D) Ensaio CCK‐8 para avaliar a viabilidade de FPH com transfecção de inibidor de miR‐181a, inibidor de miR‐181a+sh‐PDIA6 ou miR‐NC. (E–F) Coloração para SA‐β‐gal para avaliar a porcentagem de células de FPH positivas para SA‐β‐gal com a transfecção acima. As imagens das células foram fotografadas com aumento de 50×. (G–J), Western blotting para detectar a concentração de marcadores de senescência em FPH com a transfecção acima. (K–M), Mensuração das atividades de SOD, GPx e CAT em FPH transfectados com inibidor de miR‐181a, inibidor de miR‐181a+sh‐PDIA6 ou miR‐NC. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

(0.7MB).

Em seguida, os autores testaram se o miR‐181a exerce sua influência no estresse oxidativo regulando PDIA6. Como demonstrado pelos resultados, o knockdown de PDIA6 atenuou o efeito supressor nas atividades de SOD, GPx e CAT em FPH resultante do inibidor de miR‐181a (fig. 3K–M). Isso revelou que o miR‐181a sub‐regulado atenua o estresse oxidativo induzido por H2O2 tendo como alvo PDIA6.

Discussão

O dano resultante da diminuição da capacidade antioxidante e do desequilíbrio do sistema oxidativo é denominado estresse oxidativo.22 Evidências emergentes têm sugerido que o estresse oxidativo na pele é uma causa chave da senescência celular, consequentemente levando ao envelhecimento cutâneo.23,24 Estudos anteriores elucidaram o fato de que o envelhecimento e a exposição a ultravioleta B (UVB) estão fortemente correlacionados com alto risco de câncer de pele.25,26 Sugere‐se que uma quantidade aumentada de fibroblastos senescentes na pele geriátrica cause o silenciamento da expressão do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF‐1, insulin‐like growth factor 1) na pele.27 O silenciamento do IGF‐1 em fibroblastos senescentes resulta em uma resposta UVB inadequada e proliferação de queratinócitos contendo danos no DNA, o que acaba levando à fotocarcinogênese.26 Assim, encontrar uma abordagem eficaz para atenuar a senescência celular pode ajudar a reduzir o risco de câncer cutâneo.

Vários estudos demonstraram os efeitos significativos de miRNAs envolvidos no estresse oxidativo e senescência celular, como miR‐1445‐5p, miR‐570 e miR‐93‐5p.28–30 Estudos anteriores verificaram que miR‐181a desempenha um papel crucial na senescência celular.31 Foi relatado que o miR‐181a exibe expressão elevada em queratinócitos durante a senescência replicativa, sugerindo que o miR‐181a superexpresso pode desempenhar um papel promotor na senescência celular.32 No presente estudo, os autores avaliaram o papel do miR‐181a em FPH tratados com H2O2. As células senescentes são caracterizadas por interrupção do crescimento celular e expressão gênica anormal.33 Assim, o papel do miR‐181a em FPH tratados com H2O2 foi identificado pela detecção de sua influência na viabilidade celular, coloração para SA‐β‐gal e níveis de expressão de marcadores de senescência. Foi revelado que o miR‐181a sub‐regulado poderia aumentar a viabilidade celular e suprimir a senescência celular causada por H2O2 em FPH. Além disso, para detectar o impacto do miR‐181a no estresse oxidativo induzido por H2O2, foram avaliadas as atividades dos antioxidantes (SOD, GPx e CAT) que são os principais reguladores do sistema oxidativo. Verificou‐se que a inibição de miR‐181a diminuiu significativamente as habilidades antioxidantes em FPH tratados com H2O2, indicando que o knockdown de miR‐181a é capaz de suprimir o estresse oxidativo induzido por H2O2.

Os miRNAs são conhecidos por modular a expressão de alvos downstream por pareamento de bases nas sequências de mRNA 3’UTRs.34 Para descobrir como o miR‐181a exerce sua influência no estresse oxidativo e na senescência celular, a ferramenta de bioinformática ENCORI foi utilizada para rastrear os alvos downstream do miR‐181a. Entre os mRNAs selecionados, finalmente identificou‐se PDIA6 como o gene alvo do miR‐181a. PDIA6, um membro da família dissulfeto isomerase, está implicado em várias doenças humanas, como diabetes mellitus, fibrose hepática e vários tipos de câncer.35,36 Além disso, estudo anterior sugeriu que PDIA6 está intimamente relacionada à senescência celular em CTMMO humanas.19 No presente estudo, PDIA6 apresentou expressão diminuída em FPH tratados com H2O2 em comparação ao grupo controle. Curiosamente, a inibição de miR‐181a aliviou o estresse oxidativo induzido por H2O2 em FPH e a senescência celular, enquanto o knockdown de PDIA6 reverteu o impacto inibitório na senescência celular e no estresse oxidativo mediado por miR‐181a sub‐regulado. Isso sugeriu que o silenciamento do miR‐181a atenuou a senescência celular e o estresse oxidativo induzidos por H2O2 ao atuar sobre PDIA6, e a PDIA6 pode proteger os FPH contra a senescência celular induzida por H2O2.

Conclusão

O papel em potencial e o mecanismo do miR‐181a na regulação do estresse oxidativo induzido por H2O2 e a senescência celular em FPH foram investigados. Os resultados revelaram que o miR‐181a sub‐regulado pode atenuar o estresse oxidativo induzido por H2O2 e a senescência celular em FPH através da regulação da PDIA6. Os achados do presente estudo podem ajudar a desenvolver uma nova perspectiva para melhorar o envelhecimento da pele e os distúrbios associados à senescência.

Suporte financeiro

O estudo recebeu suporte financeiro do Projeto de Pesquisa em Ciências Médicas da Wuhan Municipal Health Commission (concessão n° WX20Q03).

Contribuição dos autores

Yan Huang: Revisão crítica da literatura; obtenção dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados; revisão crítica do manuscrito; elaboração e redação do manuscrito; análise estatística; concepção e planejamento do estudo; aprovação da versão final do manuscrito.

Huimin Yan: Revisão crítica da literatura; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados; revisão crítica do manuscrito; elaboração e redação do manuscrito; análise estatística; concepção e planejamento do estudo; aprovação da versão final do manuscrito.

Yanqing Yang: Obtenção, análise e interpretação dos dados; aprovação da versão final do manuscrito.

Jinfei Zhou: Obtenção, análise e interpretação dos dados; aprovação da versão final do manuscrito.

Qijun Xu: Participação efetiva na orientação da pesquisa; análise estatística; aprovação da versão final do manuscrito.

Meng Hu: Revisão crítica da literatura; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados; revisão crítica do manuscrito; elaboração e redação do manuscrito; análise estatística; aprovação da versão final do manuscrito.

Conflito de interesses

Nenhum.

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Como citar este artigo: Huang Y, Yan H, Yang Y, Zhou J, Xu O, Hu M. Downregulated miR‐181a alleviates H2O2‐induced oxidative stress and cellular senescence by targeting PDIA6 in human foreskin fibroblasts. An Bras Dermatol. 2023;98:17–25.

Trabalho realizado no Wuhan Third Hospital, Wuhan, China.

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