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Nessa forma &#233; poss&#237;vel encontrar o parasita por pesquisa direta do esfrega&#231;o do fundo de &#250;lceras recentes&#46; No entanto&#44; h&#225; outras formas de manifesta&#231;&#245;es cut&#226;neas&#44; como verrucosa&#44; papulosa&#44; nodular&#44; sarco&#237;dica&#44; placa infiltrada e vegetante&#44; nas quais a presen&#231;a do parasita no tecido &#233; rara e a histopatologia &#233; inespec&#237;fica&#44; varia de infiltrado inflamat&#243;rio linfoplasmocit&#225;rio at&#233; granuloma com ou sem necrose tecidual&#44; dificulta assim o diagn&#243;stico diferencial com outras doen&#231;as infecciosas&#44; inflamat&#243;rias e at&#233; neopl&#225;sicas&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0280"><span class="elsevierStyleSup">6&#8211;9</span></a> A imuno&#8208;histoqu&#237;mica tecidual com anticorpos antileishmania contribui para o diagn&#243;stico&#44; mas apresenta sensibilidade por volta de 66&#37; dos casos&#46; A rea&#231;&#227;o intrad&#233;rmica de Montenegro positiva &#40;&#707; 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm&#41; pode auxiliar por ter alto valor preditivo&#59; no entanto&#44; esse exame apresenta algumas limita&#231;&#245;es&#58; &#233; negativo nos primeiros meses de infec&#231;&#227;o e em pacientes an&#233;rgicos e mant&#233;m&#8208;se positivo mesmo ap&#243;s a cura da doen&#231;a&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;6</span></a></p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Assim&#44; a leishmaniose pode ser diagnosticada de v&#225;rias maneiras&#44; todas com vantagens e limita&#231;&#245;es&#46; No entanto&#44; n&#227;o h&#225; um exame padr&#227;o ouro para diagnosticar a doen&#231;a&#46; A microscopia &#233; &#250;til em &#225;reas end&#234;micas&#44; mas apresenta baixa sensibilidade e depende da avalia&#231;&#227;o de um patologista experiente&#44; al&#233;m de n&#227;o ser poss&#237;vel a identifica&#231;&#227;o das esp&#233;cies do parasita&#46; Os testes sorol&#243;gicos podem fornecer um diagn&#243;stico r&#225;pido&#44; de f&#225;cil interpreta&#231;&#227;o e s&#227;o relativamente baratos&#59; no entanto&#44; h&#225; varia&#231;&#245;es na sensibilidade e na especificidade nas diferentes regi&#245;es end&#234;micas&#44; al&#233;m da impossibilidade de identifica&#231;&#227;o das esp&#233;cies causadoras da doen&#231;a&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;3&#44;6</span></a></p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Diferentes m&#233;todos com abordagens moleculares que exploram caracter&#237;sticas espec&#237;ficas do DNA de parasitas t&#234;m sido testados para o diagn&#243;stico das leishmanioses&#46; Inicialmente&#44; as an&#225;lises de padr&#245;es de fragmentos gerados por enzimas de restri&#231;&#227;o &#40;RFLP&#41; constitu&#237;am o m&#233;todo empregando DNA como alvo na identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> e de outros tripanossomat&#237;deos&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0300"><span class="elsevierStyleSup">10&#8211;12</span></a> Outro tipo de an&#225;lise de gen&#243;tipos consiste na constru&#231;&#227;o de sondas usadas em testes de hibrida&#231;&#227;o molecular&#46; Essa t&#233;cnica foi empregada tanto em estudos discriminat&#243;rios entre esp&#233;cies fortemente relacionadas quanto para o diagn&#243;stico de infec&#231;&#245;es&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0315"><span class="elsevierStyleSup">13&#44;14</span></a> A t&#233;cnica de amplifica&#231;&#227;o aleat&#243;ria de DNA polim&#243;rfico &#40;RAPD&#41;&#44; que amplifica por rea&#231;&#227;o em cadeia da polimerase &#40;PCR&#41; fragmentos com iniciadores aleat&#243;rios&#44; tamb&#233;m foi uma t&#233;cnica adotada para analisar padr&#245;es espec&#237;ficos capazes de discriminar os organismos do g&#234;nero <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span>&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0325"><span class="elsevierStyleSup">15&#44;16</span></a> Em fun&#231;&#227;o de in&#250;meras vantagens&#44; os testes baseados na t&#233;cnica de PCR s&#227;o as principais ferramentas usadas na detec&#231;&#227;o e identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span>&#46; Essa metodologia torna poss&#237;vel&#44; al&#233;m do uso de &#237;nfimas quantidades de material biol&#243;gico&#44; a discrimina&#231;&#227;o espec&#237;fica de organismos pela an&#225;lise de polimorfismos dos alvos&#46; Diferentes t&#233;cnicas baseadas em PCR t&#234;m sido empregadas na identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> por apresentar vantagens como rapidez e sensibilidade e especificidade altas&#44; quando comparadas &#224;s t&#233;cnicas convencionais baseadas em microscopia e cultura de c&#233;lulas&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0335"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a></p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Diversas sequ&#234;ncias de DNA t&#234;m sido usadas como alvo para a identifica&#231;&#227;o espec&#237;fica de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span>&#44; como o DNA do cinetoplasto &#40;kDNA&#41;&#44;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0340"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a> o DNA riboss&#244;mico &#40;rDNA&#41;&#44;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0315"><span class="elsevierStyleSup">13&#44;14</span></a> o gene g6pd&#44; entre outros alvos&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0345"><span class="elsevierStyleSup">19&#44;20</span></a> O kDNA comp&#245;e cerca de 15&#37; do DNA do parasita e &#233; formado por uma rede de mol&#233;culas circulares concatenadas&#44; os maxic&#237;rculos e os minic&#237;rculos&#46; Por organismo&#44; s&#227;o encontrados entre 10 mil&#160;e 20 mil&#160;minic&#237;rculos com tamanho de 0&#44;5 a 2&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kb e cerca de 50 maxic&#237;rculos de 20 a 35<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kb que codificam prote&#237;nas mitocondriais e RNA riboss&#244;mico &#40;rRNA&#41; da organela&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0355"><span class="elsevierStyleSup">21&#44;22</span></a> Entre os alvos descritos na literatura&#44; o kDNA est&#225; entre os mais usados no diagn&#243;stico molecular&#46; O elevado n&#250;mero de c&#243;pias do alvo por genoma garante alta sensibilidade e constitui a principal vantagem da t&#233;cnica&#46; Por&#233;m&#44; a acur&#225;cia dos ensaios pode ser afetada pela consider&#225;vel heterogeneidade das sequ&#234;ncias de kDNA&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0365"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a></p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A caracteriza&#231;&#227;o de cistrons riboss&#244;micos de diversos tripanossomat&#237;deos viabilizou a descri&#231;&#227;o de sondas capazes de identificar alguns organismos&#46; A princ&#237;pio foi demonstrada a exist&#234;ncia de polimorfismo nas sequ&#234;ncias espa&#231;adoras de genes riboss&#244;micos em <span class="elsevierStyleItalic">Trypanosoma</span>&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0305"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a> A caracteriza&#231;&#227;o de cistrons riboss&#244;micos de seis esp&#233;cies de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> mostrou um padr&#227;o caracter&#237;stico dessas esp&#233;cies pontuado pela exist&#234;ncia de um s&#237;tio de restri&#231;&#227;o reconhecido pela enzima PvuII&#46; Esse s&#237;tio&#44; presente na sequ&#234;ncia codificadora do rRNA 18S ou SSU&#44; foi explorado na constru&#231;&#227;o de oligonucleot&#237;deos capazes de identificar o g&#234;nero&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0315"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a> Com base em polimorfismos na sequ&#234;ncia desse mesmo gene&#44; foram descritas sondas que puderam ser usadas na identifica&#231;&#227;o de diferentes grupos de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span>&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0320"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a> O sequenciamento de amplicons desse segmento g&#234;nico tem sido empregado na identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span>&#46; Dois pontos de muta&#231;&#227;o s&#227;o encontrados nas posi&#231;&#245;es 1714 e 1721<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>da sequ&#234;ncia SSU rDNA&#44; capazes de discriminar <span class="elsevierStyleItalic">&#40;Leishmania&#41; amazonensis</span> e <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;Viannia&#41;</span> spp&#46; Baseados nessa estrat&#233;gia&#44; diversos trabalhos que exploraram as caracter&#237;sticas polim&#243;rficas do SSU rDNA foram feitos com abordagens distintas&#44; focaram aspectos cl&#237;nicos&#44; epidemiol&#243;gicos&#44; ecol&#243;gicos&#44; entre outros&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0370"><span class="elsevierStyleSup">24&#8211;30</span></a></p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Entre as t&#233;cnicas de identifica&#231;&#227;o molecular mais usadas&#44; destacamos as an&#225;lises por eletroforese de isoenzimas&#44; tamb&#233;m denominadas zimodemas&#46; A glicose&#8208;6&#8208;fosfato desidrogenase &#40;G6PD&#41; &#233; uma das principais enzimas usadas na identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> por an&#225;lise de zimodemas&#46; O polimorfismo na estrutura dessas prote&#237;nas &#233; reflexo de polimorfismos em n&#237;vel g&#234;nico&#44; o que tornou poss&#237;vel o emprego de marcadores moleculares capazes de discriminar e quantificar <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> por PCR convencional e em tempo real&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0345"><span class="elsevierStyleSup">19&#44;20</span></a></p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Al&#233;m desses&#44; outros alvos de DNA descritos na literatura&#44; como os <span class="elsevierStyleItalic">internal transcribed spacers</span> &#40;ITSs&#41; presentes no cistron de rDNA&#44; o gene que codifica a prote&#237;na de choque t&#233;rmico&#44; hsp70&#44; o gene cpb &#40;<span class="elsevierStyleItalic">cysteine proteinase</span>&#41;&#44; entre outros&#44; t&#234;m sido explorados em testes de identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span>&#44; com base nas caracter&#237;sticas polim&#243;rficas do DNA&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0335"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a></p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O uso simult&#226;neo de alvos diferentes tamb&#233;m tem sido aplicado em rea&#231;&#245;es de PCR convencionais com o objetivo de discriminar os pat&#243;genos das leishmanioses&#46; A combina&#231;&#227;o de oligonucleot&#237;deos desenhados a partir da sequ&#234;ncia do gene que codifica o mini&#233;xon adicionado por trans&#8208;splicing a todos os RNA mensageiros de tripanosomat&#237;deos&#44; o SL RNA&#44; foi descrita como capaz de discriminar&#44; em uma &#250;nica rea&#231;&#227;o de PCR&#44; as esp&#233;cies causadoras da forma visceral da doen&#231;a em um grupo e as esp&#233;cies respons&#225;veis pela forma tegumentar da doen&#231;a em outros dois grupos&#44; distintos por inclu&#237;rem esp&#233;cies dos subg&#234;neros <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;Leishmania&#41;</span> ou <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;Viannia&#41;</span>&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0405"><span class="elsevierStyleSup">31&#44;32</span></a></p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Recentemente&#44; foi descrito um importante polimorfismo no gene que codifica a prote&#237;na de choque t&#233;rmico&#44; HSP70&#44; que associado &#224; an&#225;lise pela aplica&#231;&#227;o de an&#225;lises de HRM &#40;<span class="elsevierStyleItalic">High Resolution Melting</span>&#41;&#44; m&#233;todo capaz de detectar diferen&#231;as na composi&#231;&#227;o de nucleot&#237;deos de produtos espec&#237;ficos de PCR&#44; permite discriminar todas as esp&#233;cies que circulam no territ&#243;rio nacional e as esp&#233;cies mais importantes encontradas no Mediterr&#226;neo&#44; na &#205;ndia e no norte da &#193;frica&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0415"><span class="elsevierStyleSup">33</span></a> A aplica&#231;&#227;o dessa t&#233;cnica tem se revelado &#250;til no diagn&#243;stico e na identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> em diferentes amostras&#44; tanto de pacientes &#40;em bi&#243;psias a fresco&#44; como em material parafinado&#41; quanto em animais reservat&#243;rios&#44; como c&#227;es&#44; e em hospedeiros flebotom&#237;neos&#46;</p><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Testes diagn&#243;sticos que envolvem a detec&#231;&#227;o de &#225;cidos nucleicos de parasitas&#44; principalmente aqueles baseados na amplifica&#231;&#227;o espec&#237;fica de DNA&#44; como as PCR&#44; s&#227;o descritos como op&#231;&#245;es altamente sens&#237;veis e espec&#237;ficas&#44; com capacidade potencial de quantificar e identificar as esp&#233;cies infectantes&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0290"><span class="elsevierStyleSup">8&#44;34&#8211;36</span></a> An&#225;lises de HRM feitas no fim de rea&#231;&#245;es de PCR em tempo real s&#227;o capazes de detectar diferen&#231;as termodin&#226;micas no perfil de dissocia&#231;&#227;o de amplicons&#44; determinam assinaturas espec&#237;ficas como resultado de pequenas diferen&#231;as na composi&#231;&#227;o nucleot&#237;dica das esp&#233;cies&#46; A t&#233;cnica de PCR&#8208;HRM tem sido usada na identifica&#231;&#227;o n&#227;o s&#243; de esp&#233;cies de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span>&#44; mas tamb&#233;m de outros agentes infecciosos&#44; e tem sido descrita como uma ferramenta relativamente barata&#44; r&#225;pida e eficaz para detec&#231;&#227;o e discrimina&#231;&#227;o das esp&#233;cies de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> em todas as regi&#245;es end&#234;micas do mundo&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0420"><span class="elsevierStyleSup">34&#44;37&#44;38</span></a></p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">M&#233;todo</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O estudo retrospectivo foi realizado na Cl&#237;nica de Dermatologia de um hospital terci&#225;rio de S&#227;o Paulo&#44; analisou os dados de 22 pacientes com diagn&#243;stico de LTA atendidos de janeiro de 2005 a dezembro de 2018&#46; O presente estudo foi aprovado pelo Comit&#234; de &#201;tica &#40;CAAE&#58; 48719115&#46;0&#46;0000&#46;5479&#41; e os dados cl&#237;nicos&#44; epidemiol&#243;gicos e resultados de exames complementares foram obtidos em an&#225;lise de prontu&#225;rio&#46;</p><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> sp&#46; foi identificada com a aplica&#231;&#227;o da metodologia PCR&#8208;HRM&#44; como previamente descrito por nosso grupo&#44;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0415"><span class="elsevierStyleSup">33</span></a> a partir de amostra de DNA purificado dos blocos de parafina obtidos do laborat&#243;rio de patologia do hospital&#46; O envio das amostras obedeceu a um crit&#233;rio de teste cego&#44; inclusive nos casos em que mais de uma amostra foi obtida do mesmo paciente&#46; As bi&#243;psias parafinadas passaram por um processo de remo&#231;&#227;o de parafina com sucessivos banhos de xilol aquecido&#44; seguidos de banhos de etanol e posterior hidrata&#231;&#227;o da amostra&#46; O DNA das bi&#243;psias foi ent&#227;o extra&#237;do e purificado com o uso do kit DNeasy Blood &#38; Tissue &#40;Qiagen&#41;&#44; de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante&#46; Uma primeira etapa&#44; denominada pr&#233;&#8208;amplifica&#231;&#227;o&#44; foi feita com oligonucleot&#237;deos iniciadores baseados na sequ&#234;ncia do gene hsp70 de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> que amplifica&#44; por PCR convencional&#44; um segmento do DNA que cont&#233;m s&#237;tios polim&#243;rficos pass&#237;veis de serem analisados por HRM&#46; Os produtos da pr&#233;&#8208;amplifica&#231;&#227;o foram ent&#227;o submetidos a rea&#231;&#245;es de PCR em tempo real&#44; com o uso do kit MeltDoc Master Mix &#40;Life Technologies&#41;&#44; em que tr&#234;s regi&#245;es distintas do gene foram amplificadas independentemente&#46; As an&#225;lises de HRM foram feitas no fim de cada rea&#231;&#227;o de PCR em tempo real e os perfis de dissocia&#231;&#227;o de DNA foram gerados pelo <span class="elsevierStyleItalic">software</span> High Resolution Melting v&#46;&#160;3&#46;0&#46;1 &#40;Life Technologies&#41; e comparados aos perfis gerados a partir de amostras de DNA de cepas refer&#234;ncia de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> spp&#46; &#91;<span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;L&#46;&#41;</span><span class="elsevierStyleItalic">infantum chagasi</span> &#40;MCER&#47;BR&#47;1981&#47;M6445&#41;&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46;</span><span class="elsevierStyleItalic">&#40;L&#46;&#41; major</span> MHOM&#47;IL&#47;81&#47;Friedlin&#41;&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;L&#46;&#41;</span><span class="elsevierStyleItalic">amazonensis</span> &#40;MHOM&#47;BR&#47;1973&#47;M2269&#41;&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46;</span><span class="elsevierStyleItalic">&#40;L&#46;&#41; mexicana</span> &#40;MNYC&#47;BZ&#47;62&#47;M379&#41;&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46;&#160;&#40;L&#46;&#41; lainsoni</span> &#40;MHOM&#47;BR&#47;81&#47;M6426&#41;&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46;&#160;&#40;V&#46;&#41;</span><span class="elsevierStyleItalic">braziliensis</span> &#40;MHOM&#47;BR&#47;1975&#47;M2903&#41;&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;V&#46;&#41;</span><span class="elsevierStyleItalic">guyanensis</span> &#40;MHOM&#47;BR&#47;1975&#47;M4147&#41;&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;V&#46;&#41;</span><span class="elsevierStyleItalic">naiffi</span> &#40;MDAS&#47;BR&#47;1979&#47;M5533&#41; e <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;V&#46;&#41;</span><span class="elsevierStyleItalic">shawi</span> &#40;MCEB&#47;BR&#47;84&#47;M8408&#41;&#93;&#46;</p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Al&#233;m disso&#44; os resultados obtidos por PCR&#8208;HRM foram comparados aos m&#233;todos j&#225; descritos na literatura&#44; tais como sequenciamento de um segmento do gene SSU&#8208;rDNA&#44; PCR&#8208;kDNA e por RFLP &#40;<span class="elsevierStyleItalic">restriction fragment length polymorphisms</span>&#41; do gene hsp70&#46;</p></span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0055">Resultados</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">No per&#237;odo estudado foram atendidos 22&#160;pacientes com suspeita diagn&#243;stica de LTA&#46; O grupo apresentava 12&#160;pacientes do sexo masculino e 10&#160;pacientes do feminino&#46; A idade variou de&#160;13&#160;a&#160;78&#160;anos&#44; com m&#233;dia de 45&#44;72 &#177; 18&#44;41&#160;e mediana de 43&#44;50&#160;anos&#46; O tempo de dura&#231;&#227;o da les&#227;o de pele variou de um m&#234;s a 108 meses&#44; com m&#233;dia de 28&#44;31 &#177; 35&#44;49&#160;e mediana de 10&#46; A forma cl&#237;nica mais encontrada foi &#250;lcera de pele &#40;13 pacientes&#41;&#44; seguida por &#250;lceras em mucosas &#40;quatro pacientes com les&#245;es nasais e dois com orais&#41;&#44; les&#245;es cut&#226;neas papulosas &#40;dois pacientes&#41; e les&#227;o nodular cut&#226;nea em um paciente &#40;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#fig0005">figs&#46; 1 e 2</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As caracter&#237;sticas epidemiol&#243;gicas&#44; cl&#237;nicas&#44; histopatol&#243;gicas e pesquisa direta do parasita no tecido lesado dos 22&#160;pacientes inclu&#237;dos no estudo est&#227;o especificadas na <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabela 1</a>&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para diagn&#243;stico&#44; foram feitos esfrega&#231;os em les&#245;es de 17&#160;pacientes &#40;oito positivas&#41; e bi&#243;psias de pele em todos os 22&#160;pacientes &#40;14&#160;positivas&#41;&#44; com an&#225;lise de todas as amostras pela colora&#231;&#227;o de rotina &#40;hematoxilina&#8208;eosina&#41; e feitura de estudo imuno&#8208;histoqu&#237;mico para detec&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> em oito pacientes&#46; Em 10&#160;pacientes foi feita mais de uma bi&#243;psia com o intuito de diagnosticar a doen&#231;a&#46; Ao todo&#44; foram 38&#160;blocos analisados por histologia&#44; PCR&#8208;SSU&#44; PCR&#8208;kDNA&#44; SSU&#8208;Seq&#44; PCR hsp70&#8208;RFLP&#44; PCR hsp70&#8208;HRM &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabela 1</a>&#41;&#46;</p><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Onze pacientes apresentaram formas amastigotas positivas em exame de esfrega&#231;o e&#47;ou exame histol&#243;gico&#44; dos quais apenas dois pacientes foram positivos nos dois testes&#46; Em 11&#160;pacientes n&#227;o foram encontradas formas amastigotas&#44; por um ou outro teste &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabela 1</a>&#41;&#46;</p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Dos 22 pacientes com suspeita de LTA atendidos no per&#237;odo&#44; 14 tiveram a esp&#233;cie do parasita identificada por SSU&#8208;Seq&#44; PCR hsp70&#8208;RFLP ou PCR hsp70&#8208;HRM&#58; cinco casos &#40;35&#44;6&#37;&#41; de infec&#231;&#245;es por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&#44; quatro &#40;28&#44;5&#37;&#41; por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span>&#44; dois &#40;14&#44;4&#37;&#41; por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span> &#43; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; infantum chagasi</span>&#44; dois &#40;14&#44;4&#37;&#41; por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; guyanensis</span> e um &#40;7&#44;1&#37;&#41; por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; infantum chagasi</span>&#46; Interessante notar que o sequenciamento do fragmento SSU n&#227;o permite a identifica&#231;&#227;o das esp&#233;cies do subg&#234;nero <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;Viannia&#41;</span>&#44; mas houve coincid&#234;ncia da esp&#233;cie identificada&#44; ou dentro desse subg&#234;nero&#44; ou nos casos em que houve uma dupla identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span> &#43; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; infantum chagasi</span> &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabela 1</a>&#41;&#46;</p><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Das amostras de 11 pacientes em que foram detectadas formas amastigotas por meio da pesquisa direta em esfrega&#231;o de les&#227;o e&#47;ou exame histopatol&#243;gico de fragmento de pele&#44; foi poss&#237;vel identificar a esp&#233;cie do parasita em 10 delas e somente uma foi negativa pelos m&#233;todos moleculares empregados&#46; Em&#160;contrapartida&#44; das 11 amostras negativas pelos exames de esfrega&#231;o e&#47;ou exames histopatol&#243;gicos&#44; houve identifica&#231;&#227;o do protozo&#225;rio em quatro &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0010">tabela 2</a>&#41;&#46; Interessante observar que um dentre esses quatro pacientes&#44; o paciente&#160;5&#44; apresentava les&#245;es cut&#226;neas nodulares havia 108 meses&#44; de dif&#237;cil diagn&#243;stico cl&#237;nico e patol&#243;gico &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a> e <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabela 1</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0010"></elsevierMultimedia><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O PCR&#8208;SSU foi positivo para 14 dos pacientes&#59; a esp&#233;cie foi identificada em todos&#44; ou por SSU&#8208;Seq ou PCR hsp70&#8208;RFLP ou PCR hsp70&#8208;HRM&#46; Ainda&#44; no DNA desses 14 pacientes foi aplicado o teste PCR&#8208;kDNA&#44; que resultou em 12 amostras positivas&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0060">Discuss&#227;o</span><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Ainda hoje h&#225; dificuldade de fazer o diagn&#243;stico preciso em pacientes com suspeita de leishmaniose cut&#226;nea e&#47;ou mucosa nos casos em que n&#227;o s&#227;o encontrados parasitas nas les&#245;es&#46; S&#227;o solicitados v&#225;rios exames complementares para tentar chegar ao diagn&#243;stico e excluir outras doen&#231;as como micobacterioses&#44; sarcoidose&#44; linfomas&#44; micoses profundas&#44; entre outras&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;6&#44;8</span></a> Dessa maneira&#44; &#233; importante que se possa dispor de um exame r&#225;pido para diagn&#243;stico&#44; com especificidade e alta sensibilidade&#44; o que evitaria exames e consultas excessivos&#44; al&#233;m de provas terap&#234;uticas com efeitos colaterais indesej&#225;veis&#46; A introdu&#231;&#227;o da t&#233;cnica de PCR para demonstra&#231;&#227;o do parasita tem evolu&#237;do muito nos &#250;ltimos anos&#59; a t&#233;cnica acoplada com HRM&#44; que tem como alvo o gene hsp70 de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span>&#44; possibilita a identifica&#231;&#227;o laboratorial de todas as esp&#233;cies com especificidade e alta sensibilidade&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0420"><span class="elsevierStyleSup">34&#44;37&#44;38</span></a></p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Al&#233;m disso&#44; os resultados apresentados ressaltam o fato de que&#44; mesmo em se tratando de um hospital p&#250;blico terci&#225;rio de refer&#234;ncia na maior cidade do pa&#237;s&#44; o acesso a exames diagn&#243;sticos simples n&#227;o &#233; sempre dispon&#237;vel&#46; Dos&#160;22&#160;casos estudados&#44; houve a possibilidade de se fazer o estudo imuno&#8208;histoqu&#237;mico para <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> em apenas oito &#40;36&#44;3&#37;&#41;&#46; A pesquisa direta do parasita no esfrega&#231;o da les&#227;o corada com Giemsa foi o exame mais acess&#237;vel&#44; feito em 17 pacientes &#40;77&#44;2&#37;&#41;&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A demonstra&#231;&#227;o da presen&#231;a do parasita pela detec&#231;&#227;o de seu DNA se d&#225; por testes considerados potencialmente sens&#237;veis&#44; uma vez que a positividade &#233; resultado da amplifica&#231;&#227;o exponencial do alvo por PCR&#46; De fato&#44; os testes de PCR aplicados&#160;em 14 dos 22 pacientes foram positivos com SSU &#40;63&#44;64&#37;&#41; e 12 foram positivos com kDNA &#40;54&#44;55&#37;&#41; &#8211; esses tamb&#233;m foram positivos para o PCR&#8208;SSU&#46; No entanto&#44; esses alvos n&#227;o permitem a discrimina&#231;&#227;o da esp&#233;cie do parasita&#46;</p><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Houve concord&#226;ncia na identifica&#231;&#227;o da esp&#233;cie nos testes SSU&#8208;Seq&#44; hsp70&#8208;RFLP e hsp70&#8208;HRM&#44; mas ressaltamos que os dois primeiros s&#227;o testes trabalhosos&#44; que requerem a manipula&#231;&#227;o do produto de PCR&#44; al&#233;m de um t&#233;cnico treinado para executar e analisar os resultados&#46;</p><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Em um paciente em que foi detectada a presen&#231;a de amastigotas por histopatologia&#44; os testes PCR&#8208;SSU e hsp70&#8208;HRM foram negativos&#46; Uma poss&#237;vel falha na detec&#231;&#227;o de DNA do parasita pode ter explica&#231;&#245;es biol&#243;gicas ou f&#237;sico&#8208;qu&#237;micas&#46; A primeira baseia&#8208;se no fato de que les&#245;es cut&#226;neas e mucocut&#226;neas causadas principalmente por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span> t&#234;m como caracter&#237;stica comum a escassez ou aus&#234;ncia de parasitas&#44; dificultam o diagn&#243;stico laboratorial&#46; A segunda &#233; baseada no fato de que amostras biol&#243;gicas que passam por tratamentos de fixa&#231;&#227;o para an&#225;lises histol&#243;gicas est&#227;o sujeitas &#224; degrada&#231;&#227;o de DNA ou &#224; inibi&#231;&#227;o da enzima polimerase&#44; principalmente em fun&#231;&#227;o de sua exposi&#231;&#227;o &#224; formalina ou a reagentes usados na prepara&#231;&#227;o das amostras&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;3&#44;6&#44;38</span></a> No caso do paciente com evid&#234;ncia de formas amastigotas pelo exame de imuno&#8208;histoqu&#237;mica&#44; a amostra foi submetida a um teste de amplifica&#231;&#227;o do DNA do hospedeiro por PCR convencional e teve o alvo amplificado&#46; Esse teste &#233; feito como rotina para verificar a qualidade do DNA e a interfer&#234;ncia da poss&#237;vel presen&#231;a de inibidores de polimerase nas amostras&#46; Esse resultado sugere&#44; ent&#227;o&#44; que a aus&#234;ncia ou extrema escassez de parasitas nessa amostra pode ser uma explica&#231;&#227;o convincente para a negatividade do teste de detec&#231;&#227;o e identifica&#231;&#227;o do parasita&#46;</p><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span> em les&#245;es de cinco pacientes oriundos da Bahia &#40;dois&#41;&#44; do Sergipe &#40;um&#41;&#44; do Paran&#225; &#40;um&#41; e de Minas Gerais &#40;um&#41; inicialmente nos surpreendeu&#44; visto que nesses estados <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span> &#233; a esp&#233;cie mais comumente relacionada aos casos de leishmaniose cutaneomucosa&#46; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span> &#233; classicamente considerada restrita a &#225;reas da Amaz&#244;nia&#44; com transmiss&#227;o por vetores silvestres e tem como reservat&#243;rios principalmente roedores&#46; No entanto&#44; recentemente t&#234;m sido descritas mudan&#231;as no perfil epidemiol&#243;gico dessa esp&#233;cie&#46; Na Bahia&#44; onde &#233; mais comum a presen&#231;a de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span>&#44; j&#225; em 1988 foi demonstrada&#44; por meio de pain&#233;is de anticorpos monoclonais&#44; a presen&#231;a de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span> que causou les&#245;es cut&#226;neas&#44; e mais raramente&#44; les&#245;es mucosas&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0445"><span class="elsevierStyleSup">39</span></a> Em outras regi&#245;es como Mato Grosso do Sul&#44; Santa Catarina&#44; Paran&#225; e Rio de Janeiro foram identificados casos humanos isolados de leishmaniose tegumentar por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0450"><span class="elsevierStyleSup">40</span></a> Essa esp&#233;cie tamb&#233;m foi identificada em c&#227;es no estado de S&#227;o Paulo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0455"><span class="elsevierStyleSup">41&#44;42</span></a> e mais recentemente em &#225;reas end&#234;micas do Sudeste do Brasil&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0465"><span class="elsevierStyleSup">43&#44;44</span></a> Assim&#44; consideramos que existe uma possibilidade de que uma propor&#231;&#227;o desconhecida de casos de leishmaniose cut&#226;nea esteja sendo causada por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span> fora da Amaz&#244;nia&#46; Mais estudos epidemiol&#243;gicos s&#227;o necess&#225;rios j&#225; que s&#227;o descritos ind&#237;cios de que o perfil de transmiss&#227;o da leishmaniose tegumentar pode estar mudando&#46;</p><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Tamb&#233;m foi inesperado o achado de les&#227;o mucosa causada por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&#46; Raros casos humanos foram descritos na literatura&#59; entretanto&#44; j&#225; foi reproduzida experimentalmente em ratos&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0475"><span class="elsevierStyleSup">45</span></a> A identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; guyanensis</span> em dois pacientes oriundos do Nordeste do Brasil tamb&#233;m &#233; outro dado inesperado&#44; visto que essa esp&#233;cie tem ciclo de transmiss&#227;o aparentemente limitado &#224; Regi&#227;o Norte&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0480"><span class="elsevierStyleSup">46&#44;47</span></a> Por&#233;m&#44; vale ressaltar que a origem geogr&#225;fica referida nos prontu&#225;rios n&#227;o aponta onde os pacientes foram infectados&#44; desde que h&#225; uma movimenta&#231;&#227;o nas diversas regi&#245;es do pa&#237;s&#44; e informa&#231;&#245;es mais precisas nesse sentido muitas vezes s&#227;o escassas em estudos retrospectivos&#46; Por outro lado&#44; a ocorr&#234;ncia dessas esp&#233;cies fora das &#225;reas end&#234;micas alerta para a possibilidade de uma nova epidemiologia da doen&#231;a&#46; N&#227;o sabemos se est&#225; ocorrendo uma amplia&#231;&#227;o de sua distribui&#231;&#227;o geogr&#225;fica ou se essas esp&#233;cies j&#225; estavam sendo distribu&#237;das no territ&#243;rio nacional havia tempos e modifica&#231;&#245;es ambientais estariam aumentando a exposi&#231;&#227;o de animais como c&#227;es e homens a parasitas em &#225;reas onde eles n&#227;o haviam sido descritos&#46; Novos m&#233;todos de identifica&#231;&#227;o da esp&#233;cie dos parasitas permitem que sua distribui&#231;&#227;o geogr&#225;fica seja revista&#44; contribuem para o entendimento da epidemiologia da doen&#231;a&#46;</p><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A identifica&#231;&#227;o de um caso com <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; infantum chagasi</span> &#233; considerada uma raridade na LTA no Brasil&#44; visto que essa esp&#233;cie &#233; geralmente relacionada ao acometimento visceral da doen&#231;a&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0270"><span class="elsevierStyleSup">4&#44;5</span></a> Casos isolados foram descritos em associa&#231;&#227;o com infec&#231;&#227;o por HIV&#44; em pacientes jovens&#44; e at&#233; mesmo um em &#225;rea urbana do Rio de Janeiro&#44; sem qualquer comorbidade associada&#44;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a> como o caso aqui apresentado&#46; Infec&#231;&#245;es mistas causadas por mais de uma esp&#233;cie de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span>&#44; ou at&#233; mesmo com tripanossomat&#237;deos de outros g&#234;neros parasitando um mesmo hospedeiro&#44; apesar de raras&#44; t&#234;m sido descritas na literatura h&#225; alguns anos&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0490"><span class="elsevierStyleSup">48</span></a> Martinez et al&#46;&#44; em 2002&#44; descreveu o primeiro caso de detec&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span> e <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; infantum chagasi</span> em uma mesma les&#227;o em paciente boliviano&#44; situa&#231;&#227;o semelhante &#224; identificada em caso aqui apresentado&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0495"><span class="elsevierStyleSup">49</span></a> Essas duas esp&#233;cies foram encontradas em outro paciente&#44; mas em amostras distintas&#44; o que n&#227;o nos permite inferir se foram duas infec&#231;&#245;es temporalmente distintas ou uma dupla infec&#231;&#227;o inicial&#46;</p><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Este estudo apresenta limita&#231;&#245;es pelo fato de ser retrospectivo e pelo pequeno n&#250;mero de pacientes&#44; mas pode apontar&#44; pela amplia&#231;&#227;o das observa&#231;&#245;es para mais casos&#44; para novos paradigmas na identifica&#231;&#227;o de esp&#233;cies de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> relacionadas &#224;s diversas &#225;reas geogr&#225;ficas e &#224;s formas de doen&#231;a&#46; As amostras de DNA de pacientes com diagn&#243;stico final negativo para leishmaniose tamb&#233;m devem ser consideradas informativas&#46; Houve concord&#226;ncia entre os resultados negativos e a aus&#234;ncia de formas amastigostas em 19 blocos analisados de oito pacientes&#46; Em termos pr&#225;ticos&#44; um resultado negativo confi&#225;vel pode evitar a coleta de mais amostras&#44; por falha de diagn&#243;stico al&#233;m de poupar um desnecess&#225;rio tratamento quimioter&#225;pico&#46;</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Idealmente&#44; a feitura de exame de PCR para detec&#231;&#227;o e identifica&#231;&#227;o de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> deve ser acess&#237;vel &#224; maioria dos servi&#231;os de sa&#250;de de atendimento aos doentes no Brasil&#46; Anteriormente &#224; elabora&#231;&#227;o deste estudo e ao acesso &#224; identifica&#231;&#227;o das esp&#233;cies por hsp70&#8208;HRM nos blocos de parafina&#44; os pacientes atendidos em nosso servi&#231;o foram tratados com base nos dados cl&#237;nicos &#40;presen&#231;a de les&#227;o mucocut&#226;nea&#41;&#44; dados epidemiol&#243;gicos e exames complementares&#44; quando dispon&#237;veis&#46; Nota&#8208;se nos casos aqui descritos que o acesso a exames complementares n&#227;o &#233; rotina e naqueles com aus&#234;ncia de formas amastigotas h&#225; dificuldade para confirma&#231;&#227;o diagn&#243;stica&#59; dessa forma&#44; muitas vezes &#233; indicada a feitura de prova terap&#234;utica com poss&#237;veis efeitos colaterais&#44; o que muitas vezes gera desconforto e sofrimento ao paciente&#46;</p><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A identifica&#231;&#227;o das esp&#233;cies de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> &#233; importante para a escolha de tratamento&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;3&#44;47</span></a> Sabe&#8208;se que a <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span> pode levar a comprometimento de mucosas&#44; mesmo em pacientes que tiveram uma &#250;nica &#250;lcera&#44;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0265"><span class="elsevierStyleSup">3&#44;6</span></a> e h&#225; possibilidade de casos de acometimento visceral em pacientes com les&#245;es cut&#226;neas causadas por <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; infantum chagasi</span>&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0270"><span class="elsevierStyleSup">4&#44;5&#44;50</span></a> Assim&#44; nesses casos&#44; deve&#8208;se indicar tratamento sist&#234;mico em vez de locais&#44; como as infiltra&#231;&#245;es intralesionais com antimoniato de meglumina&#44; preconizadas para tratamento de les&#245;es ulceradas &#250;nicas na pele&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0265"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a></p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Conclus&#227;o</span><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O diagn&#243;stico da leishmaniose est&#225; entre os maiores desafios no que se refere ao combate &#224; doen&#231;a&#46; A identifica&#231;&#227;o correta da esp&#233;cie de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> em amostras parafinadas de pele e mucosa &#233; fonte de dados importantes para estudos ecol&#243;gicos&#44; epidemiol&#243;gicos e sobre a biologia do parasita e sua intera&#231;&#227;o com o hospedeiro e pode ser indicativa do delineamento do protocolo terap&#234;utico&#46;</p><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Dos tr&#234;s testes empregados na identifica&#231;&#227;o da esp&#233;cie&#44; dois s&#227;o muito trabalhosos e requerem t&#233;cnico treinado para a interpreta&#231;&#227;o dos resultados&#46; O fato de o resultado hsp70&#8208;HRM ser fornecido por uma m&#225;quina&#44; al&#233;m de tornar poss&#237;vel sua automa&#231;&#227;o&#44; elimina potenciais contamina&#231;&#245;es decorrentes de manipula&#231;&#245;es necess&#225;rias para a an&#225;lise de resultados obtidos por PCR convencional&#44; pois essa t&#233;cnica &#233; baseada em an&#225;lises do produto de PCR em tubos lacrados&#44; sem a necessidade de manipula&#231;&#227;o&#46;</p><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A elabora&#231;&#227;o deste trabalho tornou poss&#237;vel a identifica&#231;&#227;o de esp&#233;cies do parasita em amostras cl&#237;nicas em 10&#47;11 pacientes com formas amastigotas positivas&#46; Al&#233;m disso&#44; demonstrou a presen&#231;a de <span class="elsevierStyleItalic">Leishmania</span> em 4&#47;11 pacientes nos quais n&#227;o haviam sido encontradas formas amastigotas nas amostradas estudadas e definitivamente afastou o diagn&#243;stico de leishmaniose em 7&#47;11 pacientes com aus&#234;ncia de parasitas nos exames diretos&#46;</p><p id="par0180" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Al&#233;m de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; guyanensis</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span> e <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; infantum chagasi</span>&#44; foi detectada associa&#231;&#227;o das &#250;ltimas duas esp&#233;cies&#46; Na pr&#225;tica&#44; resultados como esse indicam que a ocorr&#234;ncia de casos tidos como raros podem ser mais comuns do que previamente descritos&#46;</p><p id="par0185" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Consideramos que estudos prospectivos com popula&#231;&#245;es maiores devem ser feitos e tamb&#233;m sugerimos aplicar a t&#233;cnica hsp70&#8208;HRM em material obtido de esfrega&#231;os&#44; o que possibilita estudos em regi&#245;es remotas do pa&#237;s&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Suporte financeiro</span><p id="par0190" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Nenhum&#46;</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Contribui&#231;&#227;o dos autores</span><p id="par0195" class="elsevierStylePara elsevierViewall">John Verrinder Veasey&#58; An&#225;lise estat&#237;stica&#59; aprova&#231;&#227;o da vers&#227;o final do manuscrito&#59; concep&#231;&#227;o e planejamento do estudo&#59; elabora&#231;&#227;o e reda&#231;&#227;o do manuscrito&#59; obten&#231;&#227;o&#44; an&#225;lise e interpreta&#231;&#227;o dos dados&#59; participa&#231;&#227;o efetiva na orienta&#231;&#227;o da pesquisa&#59; participa&#231;&#227;o intelectual em conduta proped&#234;utica e&#47;ou terap&#234;utica de casos estudados&#59; revis&#227;o cr&#237;tica da literatura&#59; revis&#227;o cr&#237;tica do manuscrito&#46;</p><p id="par0200" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Ricardo Andrade Zampieri&#58; Aprova&#231;&#227;o da vers&#227;o final do manuscrito&#59; concep&#231;&#227;o e planejamento do estudo&#59; elabora&#231;&#227;o e reda&#231;&#227;o do manuscrito&#59; obten&#231;&#227;o&#44; an&#225;lise e interpreta&#231;&#227;o dos dados&#59; participa&#231;&#227;o efetiva na orienta&#231;&#227;o da pesquisa&#59; revis&#227;o cr&#237;tica da literatura&#59; revis&#227;o cr&#237;tica do manuscrito&#46;</p><p id="par0205" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Rute Facchini Lellis&#58; Obten&#231;&#227;o&#44; an&#225;lise e interpreta&#231;&#227;o dos dados&#59; participa&#231;&#227;o intelectual em conduta proped&#234;utica e&#47;ou terap&#234;utica de casos estudados&#46;</p><p id="par0210" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Tha&#237;s Helena Proen&#231;a de Freitas&#58; An&#225;lise estat&#237;stica&#59; aprova&#231;&#227;o da vers&#227;o final do manuscrito&#59; concep&#231;&#227;o e planejamento do estudo&#59; elabora&#231;&#227;o e reda&#231;&#227;o do manuscrito&#59; obten&#231;&#227;o&#44; an&#225;lise e interpreta&#231;&#227;o dos dados&#59; participa&#231;&#227;o efetiva na orienta&#231;&#227;o da pesquisa&#59; participa&#231;&#227;o intelectual em conduta proped&#234;utica e&#47;ou terap&#234;utica de casos estudados&#59; revis&#227;o cr&#237;tica da literatura&#59; revis&#227;o cr&#237;tica do manuscrito&#46;</p><p id="par0215" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Lucile Maria Floeter Winter&#58; An&#225;lise estat&#237;stica&#59; aprova&#231;&#227;o da vers&#227;o final do manuscrito&#59; concep&#231;&#227;o e planejamento do estudo&#59; elabora&#231;&#227;o e reda&#231;&#227;o do manuscrito&#59; obten&#231;&#227;o&#44; an&#225;lise e interpreta&#231;&#227;o dos dados&#59; participa&#231;&#227;o efetiva na orienta&#231;&#227;o da pesquisa&#59; revis&#227;o cr&#237;tica da literatura&#59; revis&#227;o cr&#237;tica do manuscrito&#46;</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Conflitos de interesse</span><p id="par0220" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Nenhum&#46;</p></span></span>"
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Caracter&#237;stica das les&#245;es</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">IHQ&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">kDNA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Seq&#46;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">RFLP&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-head\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">HRM&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">MG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">4&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">PR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">4&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Mucosa nasal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">72&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">4&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">P&#225;pula&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;nariz&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">24&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">5&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">SE&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">N&#243;dulos&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">108&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">6&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;orelha&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">6&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">MG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Mucosa oral&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; &#40;Viannia&#41;</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">MG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">P&#225;pula&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;periocular&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">18&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">9&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">12&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; braziliensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">10&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Placa ulcerada&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">12&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; guyanensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">11&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">AL&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">96&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
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                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
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                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; guyanensis</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">12&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; i&#46; chagasi</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; i&#46; chagasi</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; i&#46; chagasi</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">13<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">RN&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Placa ulcerada&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis&#47; L&#46; i&#46; chagasi</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis&#47; L&#46; i&#46; chagasi</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis&#47; L&#46; i&#46; chagasi</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">14&#38;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;orelha&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">5&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis&#47; L&#46; i &#46;chagasi</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis&#47; L&#46; i&#46; chagasi</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; amazonensis&#47; L&#46; i&#46; chagasi</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">15&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">SP&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">5&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">16&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Mucosa oral&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">12&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">17&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">18&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Mucosa nasal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">60&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">19&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">MG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">4&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">20&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">BA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Mucosa nasal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">60&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">21&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">SP&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Pele&#47;membro&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">5&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
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                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">&#43;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t">22&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">SP&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
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                  \t\t\t\t">&#218;lcera&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Mucosa nasal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">&#8722;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t">NR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr></tbody></table>
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                  \t\t\t\t" scope="col">Les&#227;o cutaneomucosa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Presen&#231;a de parasita &#40;ED&#47;HP&#41;</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Aus&#234;ncia de parasita &#40;ED&#47;HP&#41;</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col">Total&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th></tr><tr title="table-row"><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">PCR&#8208;HRM positivo&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">PCR&#8208;HRM negativo&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">PCR&#8208;HRM positivo&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">PCR&#8208;HRM negativo&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t  " colspan="6" align="left" valign="\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">Pele</span></td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#218;lcera em pele&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t">7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t">1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t">3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t">13&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>P&#225;pulas&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
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Vol. 95. Issue 4.
Pages 459-468 (1 July 2020)
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10485
Vol. 95. Issue 4.
Pages 459-468 (1 July 2020)
Investigação
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Identificação de espécies de Leishmania por dissociação de DNA em alta resolução (HRM) em casos de leishmaniose tegumentar americana
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John Verrinder Veaseya,
Corresponding author
johnveasey@uol.com.br

Autor para correspondência.
, Ricardo Andrade Zampierib, Rute Facchini Lellisc, Thaís Helena Proença de Freitasa, Lucile Maria Floeter Winterb
a Clínica de Dermatologia, Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
b Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
c Departamento de Anatomia Patológica, Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
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Tabela 1. Aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais dos casos estudados
Tabela 2. Resultado da evidência do parasita pela pesquisa direta em esfregaço de lesão e/ou exame histopatológico e identificação da Leishmania sp. pelo método de PCR‐HRM correlacionando com a forma clínica
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Resumo
Fundamentos

A leishmaniose tegumentar americana é uma dermatose infecciosa causada por protozoários do gênero Leishmania e compreende amplo espectro de manifestações clínicas dependente das espécies do parasita envolvidas nas infecções e da resposta imunogenética do hospedeiro. O uso de técnicas de amplificação de DNA do parasita baseadas em reação em cadeia da polimerase (PCR) e a recente aplicação de técnicas acopladas, como a de dissociação de DNA em alta resolução, têm sido descritos como opção viável para a detecção e a identificação de Leishmania spp. em amostras biológicas.

Objetivos

Identificar as espécies de Leishmania pela técnica de PCR‐alta resolução em biópsias de pele de pacientes atendidos em hospital e comparar com resultados obtidos por outras técnicas de identificação molecular.

Métodos

Estudo retrospectivo que avaliou pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar americana atendidos em hospital da cidade de São Paulo. Biópsias parafinadas de 22 pacientes foram analisadas por PCR‐alta resolução para confirmação do diagnóstico e identificação das espécies de Leishmania.

Resultados

Dos 22 pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar americana, 14 tiveram o parasita identificado: cinco casos (35,6%) de infecção por Leishmania amazonensis, quatro (28,5%) por Leishmania braziliensis, dois (14,4%) por L. amazonensis + Leishmania infantum chagasi, dois (14,4%) por Leishmania guyanensis e um caso (7,1%) por L. infantum chagasi. Em uma das amostras em que a presença de formas amastigotas foi confirmada em exame histopatológico, a técnica de PCR‐alta resolução não detectou o DNA do parasita.

Limitações do estudo

Estudo retrospectivo com pequeno número de pacientes.

Conclusões

O método detectou e identificou espécies de Leishmania em blocos parafinados com sensibilidade de 96,4%, indicou a possibilidade de uso dessa metodologia na rotina diagnóstica.

Palavras‐chave:
Diagnóstico
Histologia
Leishmania braziliensis
Leishmania guyanensis
Leishmania infantum
Leishmaniose
Leishmaniose cutânea
Leishmaniose mucocutânea
Reação em cadeia da polimerase
Full Text
Introdução

A leishmaniose é uma doença infectoparasitária crônica causada por diversas espécies de protozoários do gênero Leishmania. No Brasil, as espécies envolvidas nas infecções que determinam as manifestações tegumentares são principalmente Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis, seguidas das espécies Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia) naiffi e Leishmania (Viannia)linderbergi, com menor incidência.1–3 Mais recentemente têm sido relatados casos isolados de leishmaniose tegumentar americana (LTA) causadas por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em pacientes com ou sem coinfecção por HIV, nas regiões Centro‐Oeste e Sudeste do país.4,5

Na pele, a apresentação clínica inicial mais comum da LTA é de úlcera emoldurada no local da inoculação do parasita pelo inseto. Nessa forma é possível encontrar o parasita por pesquisa direta do esfregaço do fundo de úlceras recentes. No entanto, há outras formas de manifestações cutâneas, como verrucosa, papulosa, nodular, sarcoídica, placa infiltrada e vegetante, nas quais a presença do parasita no tecido é rara e a histopatologia é inespecífica, varia de infiltrado inflamatório linfoplasmocitário até granuloma com ou sem necrose tecidual, dificulta assim o diagnóstico diferencial com outras doenças infecciosas, inflamatórias e até neoplásicas.6–9 A imuno‐histoquímica tecidual com anticorpos antileishmania contribui para o diagnóstico, mas apresenta sensibilidade por volta de 66% dos casos. A reação intradérmica de Montenegro positiva (˃ 5mm) pode auxiliar por ter alto valor preditivo; no entanto, esse exame apresenta algumas limitações: é negativo nos primeiros meses de infecção e em pacientes anérgicos e mantém‐se positivo mesmo após a cura da doença.1,6

Assim, a leishmaniose pode ser diagnosticada de várias maneiras, todas com vantagens e limitações. No entanto, não há um exame padrão ouro para diagnosticar a doença. A microscopia é útil em áreas endêmicas, mas apresenta baixa sensibilidade e depende da avaliação de um patologista experiente, além de não ser possível a identificação das espécies do parasita. Os testes sorológicos podem fornecer um diagnóstico rápido, de fácil interpretação e são relativamente baratos; no entanto, há variações na sensibilidade e na especificidade nas diferentes regiões endêmicas, além da impossibilidade de identificação das espécies causadoras da doença.1,3,6

Diferentes métodos com abordagens moleculares que exploram características específicas do DNA de parasitas têm sido testados para o diagnóstico das leishmanioses. Inicialmente, as análises de padrões de fragmentos gerados por enzimas de restrição (RFLP) constituíam o método empregando DNA como alvo na identificação de Leishmania e de outros tripanossomatídeos.10–12 Outro tipo de análise de genótipos consiste na construção de sondas usadas em testes de hibridação molecular. Essa técnica foi empregada tanto em estudos discriminatórios entre espécies fortemente relacionadas quanto para o diagnóstico de infecções.13,14 A técnica de amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD), que amplifica por reação em cadeia da polimerase (PCR) fragmentos com iniciadores aleatórios, também foi uma técnica adotada para analisar padrões específicos capazes de discriminar os organismos do gênero Leishmania.15,16 Em função de inúmeras vantagens, os testes baseados na técnica de PCR são as principais ferramentas usadas na detecção e identificação de Leishmania. Essa metodologia torna possível, além do uso de ínfimas quantidades de material biológico, a discriminação específica de organismos pela análise de polimorfismos dos alvos. Diferentes técnicas baseadas em PCR têm sido empregadas na identificação de Leishmania por apresentar vantagens como rapidez e sensibilidade e especificidade altas, quando comparadas às técnicas convencionais baseadas em microscopia e cultura de células.17

Diversas sequências de DNA têm sido usadas como alvo para a identificação específica de Leishmania, como o DNA do cinetoplasto (kDNA),18 o DNA ribossômico (rDNA),13,14 o gene g6pd, entre outros alvos.19,20 O kDNA compõe cerca de 15% do DNA do parasita e é formado por uma rede de moléculas circulares concatenadas, os maxicírculos e os minicírculos. Por organismo, são encontrados entre 10 mil e 20 mil minicírculos com tamanho de 0,5 a 2,5kb e cerca de 50 maxicírculos de 20 a 35kb que codificam proteínas mitocondriais e RNA ribossômico (rRNA) da organela.21,22 Entre os alvos descritos na literatura, o kDNA está entre os mais usados no diagnóstico molecular. O elevado número de cópias do alvo por genoma garante alta sensibilidade e constitui a principal vantagem da técnica. Porém, a acurácia dos ensaios pode ser afetada pela considerável heterogeneidade das sequências de kDNA.23

A caracterização de cistrons ribossômicos de diversos tripanossomatídeos viabilizou a descrição de sondas capazes de identificar alguns organismos. A princípio foi demonstrada a existência de polimorfismo nas sequências espaçadoras de genes ribossômicos em Trypanosoma.11 A caracterização de cistrons ribossômicos de seis espécies de Leishmania mostrou um padrão característico dessas espécies pontuado pela existência de um sítio de restrição reconhecido pela enzima PvuII. Esse sítio, presente na sequência codificadora do rRNA 18S ou SSU, foi explorado na construção de oligonucleotídeos capazes de identificar o gênero.13 Com base em polimorfismos na sequência desse mesmo gene, foram descritas sondas que puderam ser usadas na identificação de diferentes grupos de Leishmania.14 O sequenciamento de amplicons desse segmento gênico tem sido empregado na identificação de Leishmania. Dois pontos de mutação são encontrados nas posições 1714 e 1721da sequência SSU rDNA, capazes de discriminar (Leishmania) amazonensis e L. (Viannia) spp. Baseados nessa estratégia, diversos trabalhos que exploraram as características polimórficas do SSU rDNA foram feitos com abordagens distintas, focaram aspectos clínicos, epidemiológicos, ecológicos, entre outros.24–30

Entre as técnicas de identificação molecular mais usadas, destacamos as análises por eletroforese de isoenzimas, também denominadas zimodemas. A glicose‐6‐fosfato desidrogenase (G6PD) é uma das principais enzimas usadas na identificação de Leishmania por análise de zimodemas. O polimorfismo na estrutura dessas proteínas é reflexo de polimorfismos em nível gênico, o que tornou possível o emprego de marcadores moleculares capazes de discriminar e quantificar Leishmania por PCR convencional e em tempo real.19,20

Além desses, outros alvos de DNA descritos na literatura, como os internal transcribed spacers (ITSs) presentes no cistron de rDNA, o gene que codifica a proteína de choque térmico, hsp70, o gene cpb (cysteine proteinase), entre outros, têm sido explorados em testes de identificação de Leishmania, com base nas características polimórficas do DNA.17

O uso simultâneo de alvos diferentes também tem sido aplicado em reações de PCR convencionais com o objetivo de discriminar os patógenos das leishmanioses. A combinação de oligonucleotídeos desenhados a partir da sequência do gene que codifica o miniéxon adicionado por trans‐splicing a todos os RNA mensageiros de tripanosomatídeos, o SL RNA, foi descrita como capaz de discriminar, em uma única reação de PCR, as espécies causadoras da forma visceral da doença em um grupo e as espécies responsáveis pela forma tegumentar da doença em outros dois grupos, distintos por incluírem espécies dos subgêneros L. (Leishmania) ou L. (Viannia).31,32

Recentemente, foi descrito um importante polimorfismo no gene que codifica a proteína de choque térmico, HSP70, que associado à análise pela aplicação de análises de HRM (High Resolution Melting), método capaz de detectar diferenças na composição de nucleotídeos de produtos específicos de PCR, permite discriminar todas as espécies que circulam no território nacional e as espécies mais importantes encontradas no Mediterrâneo, na Índia e no norte da África.33 A aplicação dessa técnica tem se revelado útil no diagnóstico e na identificação de Leishmania em diferentes amostras, tanto de pacientes (em biópsias a fresco, como em material parafinado) quanto em animais reservatórios, como cães, e em hospedeiros flebotomíneos.

Testes diagnósticos que envolvem a detecção de ácidos nucleicos de parasitas, principalmente aqueles baseados na amplificação específica de DNA, como as PCR, são descritos como opções altamente sensíveis e específicas, com capacidade potencial de quantificar e identificar as espécies infectantes.8,34–36 Análises de HRM feitas no fim de reações de PCR em tempo real são capazes de detectar diferenças termodinâmicas no perfil de dissociação de amplicons, determinam assinaturas específicas como resultado de pequenas diferenças na composição nucleotídica das espécies. A técnica de PCR‐HRM tem sido usada na identificação não só de espécies de Leishmania, mas também de outros agentes infecciosos, e tem sido descrita como uma ferramenta relativamente barata, rápida e eficaz para detecção e discriminação das espécies de Leishmania em todas as regiões endêmicas do mundo.34,37,38

Método

O estudo retrospectivo foi realizado na Clínica de Dermatologia de um hospital terciário de São Paulo, analisou os dados de 22 pacientes com diagnóstico de LTA atendidos de janeiro de 2005 a dezembro de 2018. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética (CAAE: 48719115.0.0000.5479) e os dados clínicos, epidemiológicos e resultados de exames complementares foram obtidos em análise de prontuário.

A Leishmania sp. foi identificada com a aplicação da metodologia PCR‐HRM, como previamente descrito por nosso grupo,33 a partir de amostra de DNA purificado dos blocos de parafina obtidos do laboratório de patologia do hospital. O envio das amostras obedeceu a um critério de teste cego, inclusive nos casos em que mais de uma amostra foi obtida do mesmo paciente. As biópsias parafinadas passaram por um processo de remoção de parafina com sucessivos banhos de xilol aquecido, seguidos de banhos de etanol e posterior hidratação da amostra. O DNA das biópsias foi então extraído e purificado com o uso do kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Uma primeira etapa, denominada pré‐amplificação, foi feita com oligonucleotídeos iniciadores baseados na sequência do gene hsp70 de Leishmania que amplifica, por PCR convencional, um segmento do DNA que contém sítios polimórficos passíveis de serem analisados por HRM. Os produtos da pré‐amplificação foram então submetidos a reações de PCR em tempo real, com o uso do kit MeltDoc Master Mix (Life Technologies), em que três regiões distintas do gene foram amplificadas independentemente. As análises de HRM foram feitas no fim de cada reação de PCR em tempo real e os perfis de dissociação de DNA foram gerados pelo software High Resolution Melting v. 3.0.1 (Life Technologies) e comparados aos perfis gerados a partir de amostras de DNA de cepas referência de Leishmania spp. [L. (L.)infantum chagasi (MCER/BR/1981/M6445), L.(L.) major MHOM/IL/81/Friedlin), L. (L.)amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269), L.(L.) mexicana (MNYC/BZ/62/M379), L. (L.) lainsoni (MHOM/BR/81/M6426), L. (V.)braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903), L. (V.)guyanensis (MHOM/BR/1975/M4147), L. (V.)naiffi (MDAS/BR/1979/M5533) e L. (V.)shawi (MCEB/BR/84/M8408)].

Além disso, os resultados obtidos por PCR‐HRM foram comparados aos métodos já descritos na literatura, tais como sequenciamento de um segmento do gene SSU‐rDNA, PCR‐kDNA e por RFLP (restriction fragment length polymorphisms) do gene hsp70.

Resultados

No período estudado foram atendidos 22 pacientes com suspeita diagnóstica de LTA. O grupo apresentava 12 pacientes do sexo masculino e 10 pacientes do feminino. A idade variou de 13 a 78 anos, com média de 45,72 ± 18,41 e mediana de 43,50 anos. O tempo de duração da lesão de pele variou de um mês a 108 meses, com média de 28,31 ± 35,49 e mediana de 10. A forma clínica mais encontrada foi úlcera de pele (13 pacientes), seguida por úlceras em mucosas (quatro pacientes com lesões nasais e dois com orais), lesões cutâneas papulosas (dois pacientes) e lesão nodular cutânea em um paciente (figs. 1 e 2).

Figura 1.

Exemplos clínicos dos pacientes com lesões clínicas cuja pesquisa PCR‐HRM determinou a espécie de Leishmania sp. (A), paciente 11 (L. infantum chagasi); (B), paciente 13 (L. amazonensis + L. infantum chagasi); (C), Paciente 14 (L. amazonensis + L. infantum chagasi); (D), paciente 7 (L. brasiliensis); (E), paciente 3 (L. amazonensis); (F), paciente 5 (L. amazonensis).

(0.14MB).
Figura 2.

Exemplos dos pacientes com lesões clínicas cujas pesquisas PCR‐HRM não detectaram Leishmania sp. (A), paciente 17, com úlcera em membro superior; (B), paciente 21, com úlcera em membro inferior cuja biópsia evidenciou presença de amastigotas no tecido; (C), paciente 21 com úlcera em membro inferior.

(0.16MB).

As características epidemiológicas, clínicas, histopatológicas e pesquisa direta do parasita no tecido lesado dos 22 pacientes incluídos no estudo estão especificadas na tabela 1.

Tabela 1.

Aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais dos casos estudados

Características das amostrasCaracterística das lesõesEvidência do agenteTestes complementares
Paciente  Procedência (Estado)  Forma clínica  Tecido/local  Tempo de lesão (meses)  Exame direto  Histopatológico  PCR SSU  PCR  SSU  HSP70  HSP70 
            IHQ    kDNA  Seq.  RFLP  HRM 
MG  Úlcera  Pele/membro  NR  NR  L. amazonensis  L. amazonensis 
PR  Úlcera  Pele/membro  NR  L. amazonensis  NR 
BA  Úlcera  Mucosa nasal  72  −  NR  NR  L. amazonensis  L. amazonensis 
BA  Pápula  Pele/nariz  24  −  L. amazonensis  L. amazonensis  NR 
SE  Nódulos  Pele/membro  108  −  NR  L. amazonensis  L. amazonensis  L. amazonensis 
BA  Úlcera  Pele/orelha  NR  NR  NR  L. braziliensis 
MG  Úlcera  Mucosa oral  NR  L. (Viannia)  NR  L. braziliensis 
MG  Pápula  Pele/periocular  18  NR  NR  L. braziliensis 
BA  Úlcera  Pele/membro  12  NR  NR  NR  NR  L. braziliensis 
10  BA  Placa ulcerada  Pele/membro  12  NR  −  −  NR  NR  L. guyanensis 
11  AL  Úlcera  Pele/membro  96  −  NR  −  NR  NR  L. guyanensis 
12  BA  Úlcera  Pele/membro  NR  L. i. chagasi  L. i. chagasi  L. i. chagasi 
13a  RN  Placa ulcerada  Pele/membro  NR  L. amazonensis/ L. i. chagasi  L. amazonensis/ L. i. chagasi  L. amazonensis/ L. i. chagasi 
14&  BA  Úlcera  Pele/orelha  NR  L. amazonensis/ L. i .chagasi  L. amazonensis/ L. i. chagasi  L. amazonensis/ L. i. chagasi 
15  SP  Úlcera  Pele/membro  NR  −  −  NR  NR  NR  NR 
16  BA  Úlcera  Mucosa oral  12  −  NR  −  NR  NR  NR  NR 
17  BA  Úlcera  Pele/membro  −  NR  −  NR  NR  NR  NR 
18  BA  Úlcera  Mucosa nasal  60  −  NR  −  NR  NR  NR  NR 
19  MG  Úlcera  Pele/membro  −  NR  −  NR  NR  NR  NR 
20  BA  Úlcera  Mucosa nasal  60  −  NR  −  NR  NR  NR  NR 
21  SP  Úlcera  Pele/membro  NR  −  NR  NR  NR  NR 
22  SP  Úlcera  Mucosa nasal  96  −  NR  −  NR  NR  NR  NR 

NR, não realizado; e testes moleculares aplicados em duas amostras distintas, das quais uma indicou a presença de L. amazonensis e outra, L. infantum chagasi.

a

Testes moleculares aplicados indicaram a presença dos dois parasitas na mesma amostra.

Para diagnóstico, foram feitos esfregaços em lesões de 17 pacientes (oito positivas) e biópsias de pele em todos os 22 pacientes (14 positivas), com análise de todas as amostras pela coloração de rotina (hematoxilina‐eosina) e feitura de estudo imuno‐histoquímico para detecção de Leishmania em oito pacientes. Em 10 pacientes foi feita mais de uma biópsia com o intuito de diagnosticar a doença. Ao todo, foram 38 blocos analisados por histologia, PCR‐SSU, PCR‐kDNA, SSU‐Seq, PCR hsp70‐RFLP, PCR hsp70‐HRM (tabela 1).

Onze pacientes apresentaram formas amastigotas positivas em exame de esfregaço e/ou exame histológico, dos quais apenas dois pacientes foram positivos nos dois testes. Em 11 pacientes não foram encontradas formas amastigotas, por um ou outro teste (tabela 1).

Dos 22 pacientes com suspeita de LTA atendidos no período, 14 tiveram a espécie do parasita identificada por SSU‐Seq, PCR hsp70‐RFLP ou PCR hsp70‐HRM: cinco casos (35,6%) de infecções por L. amazonensis, quatro (28,5%) por L. braziliensis, dois (14,4%) por L. amazonensis + L. infantum chagasi, dois (14,4%) por L. guyanensis e um (7,1%) por L. infantum chagasi. Interessante notar que o sequenciamento do fragmento SSU não permite a identificação das espécies do subgênero L. (Viannia), mas houve coincidência da espécie identificada, ou dentro desse subgênero, ou nos casos em que houve uma dupla identificação de L. amazonensis + L. infantum chagasi (tabela 1).

Das amostras de 11 pacientes em que foram detectadas formas amastigotas por meio da pesquisa direta em esfregaço de lesão e/ou exame histopatológico de fragmento de pele, foi possível identificar a espécie do parasita em 10 delas e somente uma foi negativa pelos métodos moleculares empregados. Em contrapartida, das 11 amostras negativas pelos exames de esfregaço e/ou exames histopatológicos, houve identificação do protozoário em quatro (tabela 2). Interessante observar que um dentre esses quatro pacientes, o paciente 5, apresentava lesões cutâneas nodulares havia 108 meses, de difícil diagnóstico clínico e patológico (fig. 1 e tabela 1).

Tabela 2.

Resultado da evidência do parasita pela pesquisa direta em esfregaço de lesão e/ou exame histopatológico e identificação da Leishmania sp. pelo método de PCR‐HRM correlacionando com a forma clínica

Lesão cutaneomucosa  Presença de parasita (ED/HP)Ausência de parasita (ED/HP)Total 
  PCR‐HRM positivo  PCR‐HRM negativo  PCR‐HRM positivo  PCR‐HRM negativo   
Pele
Úlcera em pele  13 
Pápulas 
Nódulos 
Mucosa
Úlcera oral 
Úlcera nasal 
Total  10  22 

ED, pesquisa em exame direto; HP, exame histopatológico.

O PCR‐SSU foi positivo para 14 dos pacientes; a espécie foi identificada em todos, ou por SSU‐Seq ou PCR hsp70‐RFLP ou PCR hsp70‐HRM. Ainda, no DNA desses 14 pacientes foi aplicado o teste PCR‐kDNA, que resultou em 12 amostras positivas.

Discussão

Ainda hoje há dificuldade de fazer o diagnóstico preciso em pacientes com suspeita de leishmaniose cutânea e/ou mucosa nos casos em que não são encontrados parasitas nas lesões. São solicitados vários exames complementares para tentar chegar ao diagnóstico e excluir outras doenças como micobacterioses, sarcoidose, linfomas, micoses profundas, entre outras.1,6,8 Dessa maneira, é importante que se possa dispor de um exame rápido para diagnóstico, com especificidade e alta sensibilidade, o que evitaria exames e consultas excessivos, além de provas terapêuticas com efeitos colaterais indesejáveis. A introdução da técnica de PCR para demonstração do parasita tem evoluído muito nos últimos anos; a técnica acoplada com HRM, que tem como alvo o gene hsp70 de Leishmania, possibilita a identificação laboratorial de todas as espécies com especificidade e alta sensibilidade.34,37,38

Além disso, os resultados apresentados ressaltam o fato de que, mesmo em se tratando de um hospital público terciário de referência na maior cidade do país, o acesso a exames diagnósticos simples não é sempre disponível. Dos 22 casos estudados, houve a possibilidade de se fazer o estudo imuno‐histoquímico para Leishmania em apenas oito (36,3%). A pesquisa direta do parasita no esfregaço da lesão corada com Giemsa foi o exame mais acessível, feito em 17 pacientes (77,2%).

A demonstração da presença do parasita pela detecção de seu DNA se dá por testes considerados potencialmente sensíveis, uma vez que a positividade é resultado da amplificação exponencial do alvo por PCR. De fato, os testes de PCR aplicados em 14 dos 22 pacientes foram positivos com SSU (63,64%) e 12 foram positivos com kDNA (54,55%) – esses também foram positivos para o PCR‐SSU. No entanto, esses alvos não permitem a discriminação da espécie do parasita.

Houve concordância na identificação da espécie nos testes SSU‐Seq, hsp70‐RFLP e hsp70‐HRM, mas ressaltamos que os dois primeiros são testes trabalhosos, que requerem a manipulação do produto de PCR, além de um técnico treinado para executar e analisar os resultados.

Em um paciente em que foi detectada a presença de amastigotas por histopatologia, os testes PCR‐SSU e hsp70‐HRM foram negativos. Uma possível falha na detecção de DNA do parasita pode ter explicações biológicas ou físico‐químicas. A primeira baseia‐se no fato de que lesões cutâneas e mucocutâneas causadas principalmente por L. braziliensis têm como característica comum a escassez ou ausência de parasitas, dificultam o diagnóstico laboratorial. A segunda é baseada no fato de que amostras biológicas que passam por tratamentos de fixação para análises histológicas estão sujeitas à degradação de DNA ou à inibição da enzima polimerase, principalmente em função de sua exposição à formalina ou a reagentes usados na preparação das amostras.1,3,6,38 No caso do paciente com evidência de formas amastigotas pelo exame de imuno‐histoquímica, a amostra foi submetida a um teste de amplificação do DNA do hospedeiro por PCR convencional e teve o alvo amplificado. Esse teste é feito como rotina para verificar a qualidade do DNA e a interferência da possível presença de inibidores de polimerase nas amostras. Esse resultado sugere, então, que a ausência ou extrema escassez de parasitas nessa amostra pode ser uma explicação convincente para a negatividade do teste de detecção e identificação do parasita.

A identificação de L. amazonensis em lesões de cinco pacientes oriundos da Bahia (dois), do Sergipe (um), do Paraná (um) e de Minas Gerais (um) inicialmente nos surpreendeu, visto que nesses estados L. braziliensis é a espécie mais comumente relacionada aos casos de leishmaniose cutaneomucosa. L. amazonensis é classicamente considerada restrita a áreas da Amazônia, com transmissão por vetores silvestres e tem como reservatórios principalmente roedores. No entanto, recentemente têm sido descritas mudanças no perfil epidemiológico dessa espécie. Na Bahia, onde é mais comum a presença de L. braziliensis, já em 1988 foi demonstrada, por meio de painéis de anticorpos monoclonais, a presença de L. amazonensis que causou lesões cutâneas, e mais raramente, lesões mucosas.39 Em outras regiões como Mato Grosso do Sul, Santa Catarina, Paraná e Rio de Janeiro foram identificados casos humanos isolados de leishmaniose tegumentar por L. amazonensis.40 Essa espécie também foi identificada em cães no estado de São Paulo41,42 e mais recentemente em áreas endêmicas do Sudeste do Brasil.43,44 Assim, consideramos que existe uma possibilidade de que uma proporção desconhecida de casos de leishmaniose cutânea esteja sendo causada por L. amazonensis fora da Amazônia. Mais estudos epidemiológicos são necessários já que são descritos indícios de que o perfil de transmissão da leishmaniose tegumentar pode estar mudando.

Também foi inesperado o achado de lesão mucosa causada por L. amazonensis. Raros casos humanos foram descritos na literatura; entretanto, já foi reproduzida experimentalmente em ratos.45 A identificação de L. guyanensis em dois pacientes oriundos do Nordeste do Brasil também é outro dado inesperado, visto que essa espécie tem ciclo de transmissão aparentemente limitado à Região Norte.46,47 Porém, vale ressaltar que a origem geográfica referida nos prontuários não aponta onde os pacientes foram infectados, desde que há uma movimentação nas diversas regiões do país, e informações mais precisas nesse sentido muitas vezes são escassas em estudos retrospectivos. Por outro lado, a ocorrência dessas espécies fora das áreas endêmicas alerta para a possibilidade de uma nova epidemiologia da doença. Não sabemos se está ocorrendo uma ampliação de sua distribuição geográfica ou se essas espécies já estavam sendo distribuídas no território nacional havia tempos e modificações ambientais estariam aumentando a exposição de animais como cães e homens a parasitas em áreas onde eles não haviam sido descritos. Novos métodos de identificação da espécie dos parasitas permitem que sua distribuição geográfica seja revista, contribuem para o entendimento da epidemiologia da doença.

A identificação de um caso com L. infantum chagasi é considerada uma raridade na LTA no Brasil, visto que essa espécie é geralmente relacionada ao acometimento visceral da doença.4,5 Casos isolados foram descritos em associação com infecção por HIV, em pacientes jovens, e até mesmo um em área urbana do Rio de Janeiro, sem qualquer comorbidade associada,5 como o caso aqui apresentado. Infecções mistas causadas por mais de uma espécie de Leishmania, ou até mesmo com tripanossomatídeos de outros gêneros parasitando um mesmo hospedeiro, apesar de raras, têm sido descritas na literatura há alguns anos.48 Martinez et al., em 2002, descreveu o primeiro caso de detecção de L. amazonensis e L. infantum chagasi em uma mesma lesão em paciente boliviano, situação semelhante à identificada em caso aqui apresentado.49 Essas duas espécies foram encontradas em outro paciente, mas em amostras distintas, o que não nos permite inferir se foram duas infecções temporalmente distintas ou uma dupla infecção inicial.

Este estudo apresenta limitações pelo fato de ser retrospectivo e pelo pequeno número de pacientes, mas pode apontar, pela ampliação das observações para mais casos, para novos paradigmas na identificação de espécies de Leishmania relacionadas às diversas áreas geográficas e às formas de doença. As amostras de DNA de pacientes com diagnóstico final negativo para leishmaniose também devem ser consideradas informativas. Houve concordância entre os resultados negativos e a ausência de formas amastigostas em 19 blocos analisados de oito pacientes. Em termos práticos, um resultado negativo confiável pode evitar a coleta de mais amostras, por falha de diagnóstico além de poupar um desnecessário tratamento quimioterápico.

Idealmente, a feitura de exame de PCR para detecção e identificação de Leishmania deve ser acessível à maioria dos serviços de saúde de atendimento aos doentes no Brasil. Anteriormente à elaboração deste estudo e ao acesso à identificação das espécies por hsp70‐HRM nos blocos de parafina, os pacientes atendidos em nosso serviço foram tratados com base nos dados clínicos (presença de lesão mucocutânea), dados epidemiológicos e exames complementares, quando disponíveis. Nota‐se nos casos aqui descritos que o acesso a exames complementares não é rotina e naqueles com ausência de formas amastigotas há dificuldade para confirmação diagnóstica; dessa forma, muitas vezes é indicada a feitura de prova terapêutica com possíveis efeitos colaterais, o que muitas vezes gera desconforto e sofrimento ao paciente.

A identificação das espécies de Leishmania é importante para a escolha de tratamento.1,3,47 Sabe‐se que a L. braziliensis pode levar a comprometimento de mucosas, mesmo em pacientes que tiveram uma única úlcera,3,6 e há possibilidade de casos de acometimento visceral em pacientes com lesões cutâneas causadas por L. infantum chagasi.4,5,50 Assim, nesses casos, deve‐se indicar tratamento sistêmico em vez de locais, como as infiltrações intralesionais com antimoniato de meglumina, preconizadas para tratamento de lesões ulceradas únicas na pele.3

Conclusão

O diagnóstico da leishmaniose está entre os maiores desafios no que se refere ao combate à doença. A identificação correta da espécie de Leishmania em amostras parafinadas de pele e mucosa é fonte de dados importantes para estudos ecológicos, epidemiológicos e sobre a biologia do parasita e sua interação com o hospedeiro e pode ser indicativa do delineamento do protocolo terapêutico.

Dos três testes empregados na identificação da espécie, dois são muito trabalhosos e requerem técnico treinado para a interpretação dos resultados. O fato de o resultado hsp70‐HRM ser fornecido por uma máquina, além de tornar possível sua automação, elimina potenciais contaminações decorrentes de manipulações necessárias para a análise de resultados obtidos por PCR convencional, pois essa técnica é baseada em análises do produto de PCR em tubos lacrados, sem a necessidade de manipulação.

A elaboração deste trabalho tornou possível a identificação de espécies do parasita em amostras clínicas em 10/11 pacientes com formas amastigotas positivas. Além disso, demonstrou a presença de Leishmania em 4/11 pacientes nos quais não haviam sido encontradas formas amastigotas nas amostradas estudadas e definitivamente afastou o diagnóstico de leishmaniose em 7/11 pacientes com ausência de parasitas nos exames diretos.

Além de L. braziliensis, L. guyanensis, L. amazonensis e L. infantum chagasi, foi detectada associação das últimas duas espécies. Na prática, resultados como esse indicam que a ocorrência de casos tidos como raros podem ser mais comuns do que previamente descritos.

Consideramos que estudos prospectivos com populações maiores devem ser feitos e também sugerimos aplicar a técnica hsp70‐HRM em material obtido de esfregaços, o que possibilita estudos em regiões remotas do país.

Suporte financeiro

Nenhum.

Contribuição dos autores

John Verrinder Veasey: Análise estatística; aprovação da versão final do manuscrito; concepção e planejamento do estudo; elaboração e redação do manuscrito; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados; revisão crítica da literatura; revisão crítica do manuscrito.

Ricardo Andrade Zampieri: Aprovação da versão final do manuscrito; concepção e planejamento do estudo; elaboração e redação do manuscrito; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; revisão crítica da literatura; revisão crítica do manuscrito.

Rute Facchini Lellis: Obtenção, análise e interpretação dos dados; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados.

Thaís Helena Proença de Freitas: Análise estatística; aprovação da versão final do manuscrito; concepção e planejamento do estudo; elaboração e redação do manuscrito; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados; revisão crítica da literatura; revisão crítica do manuscrito.

Lucile Maria Floeter Winter: Análise estatística; aprovação da versão final do manuscrito; concepção e planejamento do estudo; elaboração e redação do manuscrito; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; revisão crítica da literatura; revisão crítica do manuscrito.

Conflitos de interesse

Nenhum.

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Como citar este artigo: Veasey JV, Zampieri RA, Lellis RF, Freitas THP, Winter LMF. Identification of Leishmania species by high‐resolution DNA dissociation in cases of American cutaneous leishmaniasis. An Bras Dermatol. 2020;95:459–68.

Trabalho realizado na Clínica de Dermatologia, Hospital da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.

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