Artigo original
Efeito do crosstalk entre células Th17 e Th9 na ativação de células musculares lisas vasculares dérmicas na esclerodermia sistêmica e regulação da tansinona IIA
Mengguo Liu
Corresponding author
Departamento de Dermatologia, Huashan Hospital, Fudan University, the 12th Urumqi Road, Xangai, China
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(A e B) A proporção de linfócitos T imaturos diferenciados em Th17 em cada grupo foi detectada utilizando citometria de fluxo. (C) O conteúdo de IL‐17 secretado por linfócitos T imaturos em cada grupo foi detectado por ELISA. Concentração de IL‐9, 20 ng/mL; concentração de anti‐IL‐9, 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>μg/mL; concentração de tansinona IIA, 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>μM. * <span class="elsevierStyleItalic">vs</span>. grupo controle, p <<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,05, *** <span class="elsevierStyleItalic">vs</span>. grupo controle, p <<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,001, <span class="elsevierStyleSup">##</span><span class="elsevierStyleItalic">vs</span>. grupo IL‐9, p <<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,01, <span class="elsevierStyleSup">###</span><span class="elsevierStyleItalic">vs</span>. grupo IL‐9, p <<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,001.</p>" ] ] ] "textoCompleto" => "<span class="elsevierStyleSections"><span id="sec0005" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Introdução</span><p id="par0005" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A esclerodermia sistêmica (ES) é doença autoimune.<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">1,2</span></a> Anormalidade autoimune, vasculopatia e alteração fibroproliferativa são três processos patológicos característicos na ES, responsáveis pelas manifestações clínicas mais graves da doença. Essas modificações também determinam o desfecho clínico da doença e a mortalidade.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a> A vasculopatia e fibrose ocorrem nos estágios iniciais, existem durante todo o curso da doença e são reguladas pela autoimunidade. A vasculopatia é caracterizada por inflamação das células endoteliais vasculares e proliferação das células do músculo liso, o que eventualmente leva à fibrose e estenose vascular.<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0135"><span class="elsevierStyleSup">4–6</span></a> Entretanto, a patogênese da vasculopatia relacionada à ES ainda não é compreendida.</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Estudos recentes mostraram aumento de células Th17 e IL‐17 na pele e no sangue periférico de pacientes com ES.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0150"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a> A IL‐17A induz inflamação das células endoteliais vasculares.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0155"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a> Também foram observadas a proliferação e a migração de células do músculo liso vascular dérmico (CMLVD) da camada média para a íntima induzidas por células Th17, bem como a transformação do fenótipo do tipo contração para o tipo sintético, que resulta em superprodução de colágeno e pode desempenhar papel‐chave na patogênese da ES.<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">9–11</span></a> Entretanto, ainda não foi elucidado se as células Th17 e outros linfócitos atuam sinergicamente na indução da função de CMLVD. Recentemente, IL‐9 e células T CD4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>+<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>produtoras de IL‐9 (células Th9) foram encontradas na ES, sugerindo que o eixo da IL‐9 possa estar envolvido na patogênese da ES.<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0175"><span class="elsevierStyleSup">12,13</span></a> Outros estudos mostraram que a IL‐9 induz a diferenciação de células Th17.<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0185"><span class="elsevierStyleSup">14,15</span></a> No entanto, nenhum dos estudos abordou especificamente se as células Th17 e Th9 interagem entre si para promover a ativação funcional de CMLVD na patogênese da ES.</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Assim, o presente estudo avaliou o efeito das células Th17 e Th9 em CMLVD derivadas de pacientes com ES. Também foi estudado o efeito regulador da tansinona IIA nesse processo. Curiosamente, foi observado que células Th17 e Th9 podem induzir a ativação de CMLVD <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> na ES por meio de “diálogo”, e a tansinona IIA inibe esse efeito. A tansinona IIA é um componente farmacologicamente ativo solúvel em gordura da erva chinesa <span class="elsevierStyleItalic">Salvia miltiorrhiza</span>, conhecido medicamento fitoterápico tradicional chinês utilizado para tratar doenças cardiovasculares e doenças do tecido conjuntivo, como lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia e artrite reumatoide. Várias pesquisas demonstraram que a tansinona IIA inibe a proliferação e migração de células musculares lisas da artéria, reduz a pressão da artéria pulmonar e melhora a remodelação da artéria pulmonar induzida por hipóxia. Enquanto isso, resultados anteriores do mesmo autor fornecem evidências preliminares de que a tansinona IIA exerce efeito inibitório na proliferação induzida por IL‐17A, na síntese de colágeno e na migração de CMLVD derivadas de pacientes com ES. Esses achados potencialmente explicam por que <span class="elsevierStyleItalic">S. miltiorrhiza</span> claramente alivia os sintomas clínicos em pacientes com ES.</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">Métodos</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Pacientes com ES e controles saudáveis</span><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Um total de 10 pacientes com ES (quatro homens e seis mulheres) foram incluídos no presente estudo após fornecerem seu consentimento informado. Todos os pacientes foram diagnosticados de acordo com os critérios de classificação de 2013 para ES e apresentaram diferentes graus de manifestações clínicas de microangiopatia (por exemplo, fenômeno de Raynaud, úlceras nos dedos das mãos, telangiectasia, hipertensão pulmonar e crise renal). Além disso, dez indivíduos saudáveis pareados por idade e sexo (cinco homens e cinco mulheres), submetidos à cirurgia para correção de doença não cutânea, foram incluídos no presente estudo. Amostras de sangue foram obtidas de pacientes com ES e dos indivíduos saudáveis. As amostras da pele de pacientes com ES foram obtidas para isolar CMLVD.</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0055">Isolamento de CMLVD derivadas de pacientes com ES</span><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A pele foi desinfetada com álcool a 75% e as amostras excisadas cirurgicamente em condições estéreis, e em seguida submetidas de seis a oito lavagens em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril e depois embebidas em álcool a 75% por 5 a 10 minutos. Posteriormente, as amostras foram lavadas com PBS contendo dois tipos de antibióticos (penicilina e estreptomicina). O tecido vascular dérmico foi isolado sob microscópio de dissecação, picado e tripsinizado. O tecido não digerido foi removido usando filtro de 200 <span class="elsevierStyleItalic">mesh</span> e centrifugado por 10 minutos a 1500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm. Por fim, as células obtidas foram ressuspensas e adicionadas ao meio basal de células de músculo liso (Promocell Heidelberg, Alemanha).</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0060">Imunofluorescência tecidual</span><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O tecido cutâneo dos pacientes com ES foi aparado, desidratado, embebido, fatiado, assado, submetido a desparafinização e reidratado. Os cortes histológicos de pele foram bloqueados com 1% de albumina de soro bovino (BSA) por 30 minutos e incubados com anticorpo primário durante a noite a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C. Após incubação com o anticorpo secundário à temperatura ambiente por 1 hora, os núcleos celulares foram corados com 49,6‐Diamidino‐2‐fenilindol (DAPI). As imagens foram digitalizadas utilizando um microscópio de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão).</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Imunofluorescência celular</span><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As CMLVD foram colocadas em placas de 24 poços com lamínulas. À confluência de 90%–100%, as células foram estimuladas por 24 horas, seguida de fixação com paraformaldeído 4% por 15 minutos e permeabilização com Triton X‐100 a 0,5% por 15 minutos. Em seguida, as células foram bloqueadas com BSA a 1% por 30 minutos e incubadas com anticorpo primário durante a noite a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C. Após a incubação com anticorpo secundário à temperatura ambiente por 1 hora, DAPI foi usado para corar os núcleos das células. 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Após o término da reação, a densidade óptica (DO) foi medida em absorção máxima de 450<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm e comprimento de onda de 630<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm. O valor calibrado de DO foi obtido subtraindo‐se o valor de 630<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm daquele de 450<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm. Os dados de concentração de IL‐9 foram apresentados como valores de média ±<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>DP.</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">RT‐PCR em tempo real</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O RNA total de CMLVD foi extraído utilizando o reagente TRIzol. Amostras de DNA complementar (cDNA) foram sintetizadas usando o <span class="elsevierStyleItalic">First Strand cDNA Synthesis Kit</span> (Yeasen, Xangai, China) e <span class="elsevierStyleItalic">primers</span> oligo (dT). Os níveis de mRNA dos genes‐alvo foram examinados utilizando <span class="elsevierStyleItalic">SYBR Green PCR Master Mix</span>. Os seguintes pares de primers foram usados:</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">IL‐9</p><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Forward</span>: TCA AGATGCTTCTGGCCATG</p><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Reverse</span>: AGGGAATGCCCAAACAGAGA</p><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">IL‐9R</p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Forward</span>: CCAGCACAGGGATCACATTG</p><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Reverse</span>: GCCTGTATAACGCTCCTCCT</p><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">β‐actina</p><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Forward</span>: AACCATGAGGGAAATCGTGC</p><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Reverse</span>: CAGGATGGCACGAGGAACAT</p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O método 2<span class="elsevierStyleSup">−ΔΔCt</span> foi usado para normalizar a transcrição ao nível de β‐actina e para calcular a modulação em relação aos controles.</p><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Triagem de células mononucleares de sangue periférico (CMSP) e células TCD4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>+<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>e detecção por citometria de fluxo</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As CMSP foram obtidas por centrifugação em gradiente de densidade usando Ficoll‐Hypaque e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS e antibióticos, após serem obtidas de pacientes com ES e controles saudáveis. O subconjunto de células T CD4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>+<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>foi categorizado usando <span class="elsevierStyleItalic">magnetic‐activated cell sorting</span> (MACS). As células induzidas foram incubadas com anticorpo anti‐CD4 humano marcado com FITC a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C durante 30 minutos. A fim de analisar mais detalhadamente a produção de IL‐9 ou IL‐17, as células foram permeadas com tampão permeável e imunomarcadas com IL‐9 anti‐humano ou IL‐17 anti‐humano conjugado com PE à temperatura ambiente durante 30 minutos. Ao final da incubação, todas as células marcadas foram analisadas por citometria de fluxo.</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Western blotting</span><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As proteínas de CMLVD foram extraídas usando tampão de lise RIPA (Beyotime, Xangai, China) suplementado com o inibidor de protease fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF). As proteínas foram separadas por SDS‐PAGE a 8% e transferidas para membranas de PVDF. Posteriormente, as membranas foram bloqueadas com leite a 5% por 2 horas em temperatura ambiente, sondadas com anticorpos primários, incluindo colágeno I (1:2000, Abcam), colágeno III (1:5000, Abcam), α‐SMA (1:1000, CST), p38 (1:1000, CST), phospho‐p38 (1:1000, CST), ERK (1:2000, CST), phospho‐ERK (1:1000, CST), e GAPDH (1:5000, Proteintech) durante a noite a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C e, então, incubadas com anticorpos secundários adequados conjugados com peroxidase de rábano (HRP) por 1,5 hora à temperatura ambiente. As proteínas foram detectadas usando reagentes de detecção ECL.</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Análise estatística</span><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Os dados foram analisados estatisticamente com o <span class="elsevierStyleItalic">software</span> SPSS, versão 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os dados quantitativos são expressos como média<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>±<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>desvio padrão (DP). Os dados entre o grupo de pacientes e o de indivíduos saudáveis foram analisados usando o teste <span class="elsevierStyleItalic">t</span> de Student. Os dados entre múltiplos grupos foram analisados usando análise de variância (ANOVA) unidirecional combinada com correção de Bonferroni; o valor de p <<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,05 foi estatisticamente significativo.</p></span></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Resultados</span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Correlação entre Th9 e ES</span><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Em comparação com indivíduos normais, IL‐9R e IL‐17R foram altamente expressos nas lesões de pele de pacientes com ES (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>). Os níveis de mRNA de IL‐9 e IL‐9R de CMSP e os níveis de IL‐9 no soro de pacientes com ES estavam aumentados (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig. 2</a>). A citometria de fluxo mostrou que a proporção de células T CD4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>+<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>IL‐9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>+<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>em CMSP de pacientes com ES foi significativamente maior (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>). A proporção de Th9 foi associada à ES.</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0115" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Cross‐talk entre células Th17 e Th9 in vitro e regulação da tansinona IIA</span><span id="sec0120" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">A IL‐9 e o soro de ES promovem a diferenciação de Th17 e a reversão do efeito da tansinona IIA</span><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Os resultados mostraram que a proporção de células Th17 nos grupos de IL‐9 e soro de ES foi significativamente maior do que no grupo controle; no entanto, a proporção de células Th17 no grupo do anticorpo neutralizante de IL‐9 foi significativamente menor do que no grupo controle, e o anticorpo neutralizante de IL‐9 diminuiu o efeito promotor do soro nas células Th17 (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>A). Esses achados indicaram que a IL‐9 estimula a diferenciação de linfócitos T imaturos em células Th17 <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>, bem como a diferenciação de linfócitos T imaturos em células Th17. Os dados mostraram que a tansinona IIA diminui a proporção de Th17 e inibe o efeito do soro de ES nas células Th17 em comparação com o controle (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>B). Além disso, o conteúdo de IL‐17 no sobrenadante da cultura de cada grupo foi detectado por ELISA. Esses resultados mostraram que a IL‐9 e o soro de ES promovem significativamente a secreção de IL‐17 por linfócitos T imaturos, enquanto o anticorpo neutralizante de IL‐9 e a tansinona IIA inibem significativamente a secreção de IL‐17 por linfócitos T imaturos e reverte o efeito desencadeante da IL‐9 e do soro de ES (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>C).</p><elsevierMultimedia ident="fig0020"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0125" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">IL‐17 e soro de ES promovem a diferenciação de Th9 e o efeito reverso da tansinona IIA</span><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Os resultados mostraram que a proporção de células Th9 nos grupos de IL‐17 e soro de ES foi significativamente maior do que no grupo controle; no entanto, a proporção de células Th9 no grupo de anticorpos neutralizantes de IL‐17 foi significativamente menor do que no grupo controle, e o anticorpo neutralizante da IL‐17 diminuiu o efeito promotor do soro nas células Th9 (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>A). Esses achados indicaram que a IL‐17 estimula a diferenciação de linfócitos T imaturos em células Th9 <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>, e a IL‐17 no soro de pacientes com ES estimula a diferenciação de linfócitos T imaturos em células Th9. Além disso, a tansinona IIA diminui a proporção de Th9 e inibe o efeito promotor do soro de ES nas células Th9 em comparação com o controle (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>B). Adicionalmente, o conteúdo de IL‐9 no sobrenadante de cultura de cada grupo foi detectado por ELISA. Os resultados mostraram que IL‐17 e o soro de ES promoveram significativamente a secreção de IL‐9 por linfócitos T imaturos, enquanto o anticorpo neutralizante de IL‐17 e a tansinona IIA inibiram significativamente a secreção de IL‐9 por linfócitos T imaturos e reverteram o efeito promotor da IL‐17 e do soro de ES (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>C).</p><elsevierMultimedia ident="fig0025"></elsevierMultimedia></span></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Efeitos da IL‐17 e IL‐9 na ativação funcional de CMLVD e regulação da tansinona IIA</span><span id="sec0130" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">IL‐9 e soro da ES promovem a expressão de IL‐17R em CMLVD, e tansinona IIA reverte esse efeito</span><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As CMLVD de pacientes com ES foram isoladas e incubadas com IL‐9, anticorpo neutralizante de IL‐9, soro de ES, soro de ES e anticorpo neutralizante de IL‐9, tansinona IIA, IL‐9 e tansinona IIA, e soro de ES e tansinona IIA por três dias. A expressão de IL‐17R foi detectada por imunofluorescência. Os resultados mostraram que a IL‐9 e o soro de ES promovem significativamente a expressão de IL‐17R, e o anticorpo neutralizante de IL‐9 e a tansinona IIA reverteram o efeito promotor da IL‐9 e do soro de ES (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0030">fig. 6</a>).</p><elsevierMultimedia ident="fig0030"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0135" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">IL‐17 e soro de ES promovem a expressão de IL‐9R em CMLVD, e tansinona IIA reverte esse efeito</span><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As CMLVD foram incubadas com IL‐17, anticorpo neutralizante de IL‐17, soro de ES, soro de ES e anticorpo neutralizante de IL‐17, tansinona IIA, IL‐17 e tansinona IIA, e soro de ES e tansinona IIA por três dias. A expressão de IL‐9R foi detectada por imunofluorescência. Os resultados mostraram que a IL‐17 e o soro de ES promovem significativamente a expressão de IL‐9R, e o anticorpo neutralizante de IL‐17 e tansinona IIA reverteram o efeito promotor de IL‐17 e do soro de ES (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0035">fig. 7</a>).</p><elsevierMultimedia ident="fig0035"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0140" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">IL‐9 e soro de ES promovem a ativação funcional de CMLVD, e tansinona IIA reverte esse efeito</span><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As CMLVD foram incubadas com IL‐9, IL‐9 e anticorpos neutralizantes de IL‐9, IL‐9 e tansinona IIA, soro de ES, soro de ES e anticorpos neutralizantes de IL‐9 e soro de ES e tansinona IIA por três dias. Colágeno I, colágeno III, α‐SMA, P‐P38, P38, P‐ERK e ERK foram detectados por WB. Os resultados mostraram que a IL‐9 e o soro de ES promovem significativamente a expressão de colágeno I, colágeno III, α‐SMA, P‐P38 e P‐ERK. Além disso, o anticorpo neutralizante de IL‐9 e a tansinona IIA reverteram os efeitos da IL‐9 e do soro de ES (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0040">fig. 8</a>).</p><elsevierMultimedia ident="fig0040"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0145" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0135">IL‐17 e soro de ES promovem a ativação funcional de CMLVD, e tansinona IIA reverte esse efeito</span><p id="par0185" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As CMLVD foram incubadas com IL‐17, IL‐17 e anticorpos neutralizantes de IL‐17, IL‐17 e tansinona IIA, soro de ES, soro de ES e anticorpos neutralizantes de IL‐17 e soro de ES e tansinona IIA por três dias. Colágeno I, colágeno III, α‐SMA, P‐P38, P38, P‐ERK e ERK foram detectados por WB. Os resultados mostraram que a IL‐17 e o soro de ES promovem significativamente a expressão de colágeno I, colágeno III, α‐SMA, P‐P38 e P‐ERK. O anticorpo neutralizante de IL‐17 e a tansinona IIA reverteram os efeitos da IL‐17 e do soro de ES (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0045">fig. 9</a>).</p><elsevierMultimedia ident="fig0045"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0150" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0140">Tansinona IIA inibe o efeito sinérgico de IL‐9 e IL‐17 na ativação funcional de CMLVD</span><p id="par0195" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As CMLVD foram tratadas com IL‐17, IL‐9, IL‐17 e IL‐9, anticorpo neutralizante de IL‐17 e anticorpo neutralizante de IL‐9, IL‐17 e IL‐9 e tansinona IIA, soro de ES, soro de ES/anticorpo neutralizante de IL‐17/anticorpo neutralizante de IL‐9 e soro de ES e tansinona IIA por três dias. As proteínas foram coletadas para detecção por WB de colágeno I, colágeno III, α‐SMA, P‐P38, P38, P‐ERK e ERK. Os resultados mostraram que a IL‐17, IL‐9 e soro de ES promovem significativamente a expressão de colágeno I, colágeno III, α‐SMA, P‐P38 e P‐ERK. Além disso, os anticorpos neutralizantes de IL‐9 e IL‐17 e a tansinona IIA inibiram o efeito sinérgico de IL‐9 e IL‐17 (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0050">fig. 10</a>).</p><elsevierMultimedia ident="fig0050"></elsevierMultimedia></span></span></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0145">Discussão</span><p id="par0200" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Th9, um subconjunto definido de células T‐<span class="elsevierStyleItalic">helper</span>, foi identificado pela potente produção de IL‐9, proteína de 144 aminoácidos com sequência de sinal secretor de 18 aminoácidos.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0195"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a> Curiosamente, a IL‐9 se liga ao IL‐9R em células‐alvo.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> Embora o papel do subconjunto de células Th9 tenha sido descrito recentemente em muitos tipos de doenças inflamatórias (especificamente, doenças atópicas, inflamação parasitária, encefalomielite autoimune experimental e doenças inflamatórias intestinais),<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0205"><span class="elsevierStyleSup">18–23</span></a> o papel na patogênese de doenças reumáticas, como ES, ainda é desconhecido.</p><p id="par0205" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A presença de altos níveis de IL‐9 e a forte expressão de Th9 na ES questionam a possível participação das células Th9 na patogênese da ES. No presente estudo, houve forte expressão de IL‐9R que foi demonstrada recentemente no tecido cutâneo de pacientes com ES. Além disso, a expressão de IL‐9 foi observada nas CMSP de pacientes com ES. A maioria das células produtoras de IL‐9 na pele foram identificadas como células Th9. Entre as células mononucleares do sangue periférico, as células Th9 são a principal fonte de IL‐9, que está significativamente aumentada em pacientes com ES em comparação com os controles. A participação de IL‐9 e Th9 no processo de inflamação e fibrose na ES ainda precisa ser elucidada.</p><p id="par0210" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A pesquisa anterior do autor confirmou que IL‐17 e Th17 aumentam a proliferação, síntese e secreção de colágeno e a migração de CMLVD derivadas de pacientes com ES por meio da via de sinalização de proteína quinase ativada por mitógeno (MAPKs).<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a> Além disso, o estudo anterior também demonstrou que a tansinona IIA (C19H18O3), um componente farmacologicamente ativo lipossolúvel da erva chinesa <span class="elsevierStyleItalic">S. miltiorrhiza</span>, conhecido medicamento fitoterápico tradicional chinês usado no tratamento de doenças cardiovasculares e do tecido conjuntivo, exerce efeito inibitório na ativação funcional de CMLVD derivadas de pacientes com ES.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a></p><p id="par0215" class="elsevierStylePara elsevierViewall">O presente estudo se concentra nos coefeitos das células Th17 e Th9 em CMLVD derivadas de pacientes com ES. O autor também estudou o efeito regulador da tansinona IIA nesse processo. Th17 e Th9 promovem sua diferenciação de linfócitos T imaturos por meio das citocinas características IL‐17 e IL‐9. IL‐17, IL‐9 e soro de ES promoveram a expressão de colágeno I, colágeno III, α‐SMA, P‐P38 e P‐ERK, induzindo a ativação funcional de CMLVD. O aumento da síntese de colágeno e secreção de CMLVD indica o agravamento da angiopatia e fibrose na ES. Entretanto, os anticorpos neutralizantes de IL‐17 e IL‐9 e a tansinona IIA revertem os efeitos.</p><p id="par0220" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Vários aspectos das evidências da pesquisa demonstraram a estreita associação de Th9 com o desenvolvimento de células Th17. Primeiro, a IL‐9 poderia induzir a diferenciação de células T‐CD4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>+<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>virgens em células Th17. Segundo, a IL‐9 amplifica o desenvolvimento de Th17 em um <span class="elsevierStyleItalic">loop</span> autócrino positivo. Além disso, a IL‐9 pode estar envolvida no desenvolvimento de doenças autoimunes por meio de inflamação e vasculopatia associadas a Th17. Consistente com a relação entre IL‐9 e desenvolvimento de células Th17, uma correlação positiva de células Th9 com células Th17, bem como de IL‐9 com IL‐17, foi observada em pacientes com ES, indicando que Th9/IL‐9 e Th17/IL‐17 podem estar envolvidas de maneira cooperativa na patogênese da ES. Entretanto, o mecanismo exato pelo qual Th9 e Th17 regulam umas às outras durante o desenvolvimento da ES permanece incerto e requer mais investigações.</p></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0150">Conclusões</span><p id="par0225" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Os resultados desse estudo revelaram o efeito da interação de células T na ativação funcional de CMLVs na ES. Assim, detectou‐se a correlação entre a anormalidade imune celular e a angiogênese na patogênese da ES, o que fornece uma base teórica e experimental para encontrar novos alvos terapêuticos e medicamentos para a ES.</p></span><span id="sec0100" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0155">Suporte financeiro</span><p id="par0250" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Este trabalho recebeu suporte financeiro da National Natural Science Foundation of China (81602747).</p></span><span id="sec0105" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0160">Contribuição do autor</span><p id="par0255" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Mengguo Liu projetou e conduziu os experimentos, realizou a análise estatística e escreveu e revisou o manuscrito.</p></span><span id="sec0110" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0165">Conflito de 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expressão do receptor de interleucina 17 (IL‐17R) e do receptor de interleucina 9 (IL‐9R) na pele de pacientes com ES foi avaliada por imunofluorescência. A expressão do mRNA de IL‐9 e IL‐9R em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de pacientes com ES foi detectada por reação em cadeia da polimerase em tempo real ou quantitativa (qRT‐PCR). A proporção de células Th9 em CMSP de pacientes com ES foi determinada por citometria de fluxo. O efeito da IL‐9 na diferenciação de Th17 e IL‐17 na diferenciação de Th9 foi detectado por citometria de fluxo. A proporção de células Th9 e Th17 em pacientes com ES foi detectada por citometria de fluxo. Os níveis de colágeno I, III, α‐SMA, IL‐9R, IL‐17R, JNK, P38 e ERK foram analisados utilizando <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span> (WB).</p></span> <span id="abst0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0020">Resultados</span><p id="spar0015" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">As células Th9 foram altamente expressas em ES. A IL‐9 estimulou a diferenciação de células T imaturas em células Th17. A IL‐17 induziu a diferenciação de células T imaturas em células Th9. A tansinona IIA inibiu a diferenciação de linfócitos T imaturos em Th17 e Th9. O método WB mostrou que a ação combinada de IL‐17 e IL‐9 aumentou a inflamação e proliferação de CMLVD. Anti‐IL17, anti‐IL9 e tansinona IIA inibiram a ativação funcional de CMLVD.</p></span> <span id="abst0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0025">Limitações do estudo</span><p id="spar0020" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Para Th17, Th9 e células musculares lisas vasculares, o estudo sobre a via de sinalização de sua interação não é suficientemente completo. Estudos mais detalhados são necessários para explorar o mecanismo de interação célula‐célula.</p></span> <span id="abst0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0030">Conclusões</span><p id="spar0025" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Os resultados atuais sugerem que células Th17 e Th9 induziram a ativação de CMLVD na ES por meio de <span class="elsevierStyleItalic">crosstalk</span><span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>, e a tansinona IIA inibiu o processo.</p></span>" "secciones" => array:5 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "abst0005" "titulo" => "Fundamentos" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "abst0010" "titulo" => "Métodos" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "abst0015" "titulo" => "Resultados" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "abst0020" "titulo" => "Limitações do estudo" ] 4 => array:2 [ "identificador" => "abst0025" "titulo" => "Conclusões" ] ] ] ] "NotaPie" => array:2 [ 0 => array:2 [ "etiqueta" => "☆" "nota" => "<p class="elsevierStyleNotepara" id="npar0005">Como citar este artigo: Liu M. Effect of crosstalk between Th17 and Th9 cells on the activation of dermal vascular smooth muscle cells in systemic scleroderma and regulation of tanshinone IIA. An Bras Dermatol. 2022;97:716–28.</p>" ] 1 => array:2 [ "etiqueta" => "☆☆" "nota" => "<p class="elsevierStyleNotepara" id="npar0010">Trabalho realizado no Departamento de Dermatologia e Laboratório Central, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Xangai, China.</p>" ] ] "multimedia" => array:10 [ 0 => array:7 [ "identificador" => "fig0005" "etiqueta" => "Figura 1" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr1.jpeg" "Alto" => 2489 "Ancho" => 2508 "Tamanyo" => 638186 ] ] "descripcion" => array:1 [ "pt" => "<p id="spar0030" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">IL‐17R e IL‐9R mostraram alta expressão na pele de pacientes com ES. 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(C) Alta expressão de IL‐9 no soro de pacientes com ES. <span class="elsevierStyleItalic">N</span>, Normal; <span class="elsevierStyleItalic">P</span>, Paciente. * <span class="elsevierStyleItalic">vs</span>. N, p <<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,05. ** <span class="elsevierStyleItalic">vs</span>. N, p <<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,01. *** <span class="elsevierStyleItalic">vs</span>. 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(A e B) A proporção de linfócitos T imaturos diferenciados em Th17 em cada grupo foi detectada utilizando citometria de fluxo. (C) O conteúdo de IL‐17 secretado por linfócitos T imaturos em cada grupo foi detectado por ELISA. 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(A e B) A proporção de linfócitos T imaturos diferenciados em Th9 em cada grupo foi detectada utilizando citometria de fluxo. (C) O conteúdo de IL‐9 secretado por linfócitos T imaturos em cada grupo foi detectado por ELISA. 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(A) Bandas imunorreativas de <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span> de várias proteínas. A IL‐17 promove a expressão de várias proteínas em CMLVD, que é inibida pela tansinona IIA. (B–H) Os resultados de <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span> de colágeno I, colágeno III, α‐SMA, P‐P38, P‐ERK e ERK são expressos na forma de gráficos estatísticos.</p>" ] ] 9 => array:7 [ "identificador" => "fig0050" "etiqueta" => "Figura 10" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr10.jpeg" "Alto" => 2977 "Ancho" => 3346 "Tamanyo" => 844565 ] ] "descripcion" => array:1 [ "pt" => "<p id="spar0075" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">A expressão de várias proteínas relacionadas à fibrose e relacionadas à via de sinalização em CMLVD funcionais ativadas foi detectada por <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span>. (A) Bandas imunorreativas de <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span> de várias proteínas. IL‐9 e IL‐17 desempenham papel sinérgico na promoção da expressão de várias proteínas em CMLVD, que é inibida pela tansinona IIA. (B–H) Dados de <span class="elsevierStyleItalic">Western blotting</span> de colágeno I, colágeno III, α‐SMA, P‐P38, P‐ERK e ERK são representados como gráficos.</p>" ] ] ] "bibliografia" => array:2 [ "titulo" => "Referências" "seccion" => array:1 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "bibs0015" "bibliografiaReferencia" => array:23 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "bib0120" "etiqueta" => "1" "referencia" => array:1 [ 0 => array:2 [ "contribucion" => array:1 [ 0 => array:2 [ "titulo" => "T and B lymphocytes in fibrosis and systemic sclerosis" "autores" => array:1 [ 0 => array:2 [ "etal" => false "autores" => array:1 [ 0 => "S. 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Article information
ISSN: 26662752Original language: Portuguese
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